水族和仡佬族人群B淋巴細(xì)胞永生細(xì)胞株構(gòu)建,醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)論文

水族和仡佬族人群B淋巴細(xì)胞永生細(xì)胞株構(gòu)建,醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)論文人類基因組的遺傳多樣性不僅為研究人類種族和群體的源流、進(jìn)化和遷移提供生物學(xué)根據(jù)，而且可為研究疾病發(fā)生發(fā)展及臨床藥物和生物制品的研發(fā)提供幫助。通過建立永生細(xì)胞系來長期保存不同民族和群體的基因組，對(duì)于保存和利用中國不同民族遺傳資源具有重要的戰(zhàn)略意義[1].水族與仡佬族因其起源及所處地理位置的不同，并且歷史上有過瘧疾等傳染病流行，構(gòu)成了與中國其他民族有所不同的基因多態(tài)性，如在Y染色體多態(tài)性、線粒體遺傳多態(tài)性和ABO血型分布及基因頻率上具有本身的特點(diǎn)，與其他民族有較大的遺傳差異[2-4].當(dāng)前中華民族永生細(xì)胞庫中還缺乏水族和仡佬族的永生細(xì)胞株[1].本研究采用人類皰疹病毒〔Epstein-Barrvirus,EBV〕轉(zhuǎn)化結(jié)合環(huán)孢霉素選擇方式方法，擬建立貴州省水族和仡佬族人群B淋巴細(xì)胞永生細(xì)胞株，并使其成為可連續(xù)傳代的淋巴母細(xì)胞〔LCLs〕,結(jié)果報(bào)告如下。1材料與方式方法1.1材料144份水族和124份仡佬族人外周靜脈血樣分別采自貴州省三都水族自治縣和務(wù)川仡佬族苗族自治縣，對(duì)象均是本民族世居居民，至少是三代純系，健康狀況良好，互相之間無親緣關(guān)系，年齡為18~60歲，男女各半；遵從知情同意和自愿參加原則，每個(gè)個(gè)體采集5mL外周靜脈血，4-羥乙基呱嗪乙磺酸抗凝，常溫放置及運(yùn)輸，于24~48h內(nèi)到達(dá)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化。1.2主要試劑與儀器1640培養(yǎng)基、100mmol/L丙酮酸鈉和4-羥乙基呱嗪乙磺酸〔HEPES〕〔上海Hyclone公司〕;胎牛血清〔美國Gibco公司〕;淋巴細(xì)胞分離液Ficoll〔美國PerkinElmer公司〕;環(huán)孢素A〔美國Switerzland公司〕;200mol/L谷氨酰胺〔昆明醫(yī)學(xué)生物所〕,EB病毒株B-958細(xì)胞〔中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所〕.倒置光學(xué)顯微鏡〔日本Nikon公司〕,CO2培養(yǎng)箱〔美國Thermo公司〕.1.3永生細(xì)胞系建立1.3.1EBV轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞以下為參考文獻(xiàn)[5]方式方法進(jìn)行，EBV懸液來自B-958細(xì)胞培養(yǎng)上清液，B-958細(xì)胞饑餓培養(yǎng)4~6d,離心收集上清液，經(jīng)0.22m過濾，獲得EBV液，取新鮮外周血5mL,與5mL1640細(xì)胞洗液〔含有200U/mL青霉素和200g/mL鏈霉素〕混勻后，2500r/min離心30min,汲取中間白色細(xì)胞層，懸浮于1640洗液中，1000r/min離心10min,棄上清，參加1mL1640全營養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)液〔含20%胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL鏈霉素、2mmol/L谷氨酰胺、10mol/L丙酮酸鈉、20mmol/LHEPES〕懸浮細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，參加4mLEBV懸液，置搖床，37℃，120r/min1h,參加1640全營養(yǎng)液至終體積10mL,并參加環(huán)孢素A達(dá)終濃度2g/mL,置37℃，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并逐日觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及生長狀況。1.3.2細(xì)胞群體倍增時(shí)間測定收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，每瓶1105個(gè)細(xì)胞接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，連續(xù)培養(yǎng)7d,每24h取3瓶細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均數(shù)；以培養(yǎng)時(shí)間〔d〕為橫坐標(biāo)，細(xì)胞濃度為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞的群體倍增時(shí)間，t=△tlg2/〔lgNt-lgN0〕,華而不實(shí)Nt為t時(shí)間的細(xì)胞數(shù)，N0為理論初始細(xì)胞數(shù)。1.3.3細(xì)胞凍存與復(fù)蘇細(xì)胞凍存：收集細(xì)胞，懸浮于凍存液里，吹打均勻，每支凍存管分裝1mL懸浮細(xì)胞，凍存管依次在4℃、-20℃、-80℃冰箱各放置1h,最后放入液氮罐中，最終放入液氮冰箱永久保存。細(xì)胞復(fù)蘇：取液氮中凍存細(xì)胞，迅速在37℃~38℃水中快速融化，用洗液洗滌1次，1000r/min離心10min,棄上清，細(xì)胞懸浮于1640全營養(yǎng)培養(yǎng)液中。置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。1.3.4支原體檢測將細(xì)胞懸液1mL及2mL無支原體滅活小牛血清，參加8mL預(yù)冷至56℃左右的半流體支原體培養(yǎng)基中，充分混勻后，置于36℃溫箱中培養(yǎng)，設(shè)置陽性及陰性對(duì)照，每隔3d觀察1次，持續(xù)觀察21d,支原體陽性斷定以下為參考文獻(xiàn)[1].2結(jié)果2.1EBV轉(zhuǎn)化細(xì)胞及細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化〔圖1〕光學(xué)顯微鏡下可見淋巴細(xì)胞在EBV感染后第2~3天起開場透亮，部分細(xì)胞由原來的圓形變?yōu)椴灰?guī)則形態(tài)，少部分細(xì)胞變形變大；約7~10d后，形態(tài)不規(guī)則的細(xì)胞變大，即淋巴母細(xì)胞化，可觀察到有更多形態(tài)各異的細(xì)胞〔圖1A〕;細(xì)胞逐步聚集生長，并出現(xiàn)轉(zhuǎn)化而構(gòu)成的細(xì)胞聚集〔B淋巴細(xì)胞克隆〕,隨后細(xì)胞克隆逐步增加增大，繼續(xù)培養(yǎng)2周后，肉眼可見到白色細(xì)胞團(tuán)塊〔圖1B〕.2.2轉(zhuǎn)化后細(xì)胞凍存復(fù)蘇及支原體污染狀況細(xì)胞株約5~7d可進(jìn)行傳代；所有細(xì)胞株均能持續(xù)傳代、凍存復(fù)蘇后，細(xì)胞均生長良好，隨機(jī)支原體檢測結(jié)果為陰性。建成水族人永生細(xì)胞株138株，仡佬族人115株，細(xì)胞轉(zhuǎn)化陽性率分別為95.8%和92.7%.2.3細(xì)胞生長曲線和倍增時(shí)間細(xì)胞生長曲線顯示，細(xì)胞培養(yǎng)的延遲期較短，很快進(jìn)入細(xì)胞對(duì)數(shù)期，群體中快速增殖的細(xì)胞占優(yōu)勢；經(jīng)過5d時(shí)間，進(jìn)入平臺(tái)期；通過公式計(jì)算，細(xì)胞群體的倍增時(shí)間是48h,表示清楚細(xì)胞具有旺盛的生長能力。3討論由于在民族源流、自然選擇因素等方面的不同，水族和仡佬族人群呈現(xiàn)出與中國其他民族既有類似又有不同的遺傳多樣性特點(diǎn)。研究表示清楚，貴州仡佬族等百越族群民族在單倍型上具有類似性，并可能與氐羌等其他民族發(fā)生過較大的基因融合，表現(xiàn)出百越與外族之間基因成分的相互溝通[2].貴州少數(shù)民族線粒體多態(tài)性的研究表示清楚，水族是一個(gè)古老的南方民族群體，總體表現(xiàn)出與壯族接近但又具有不同的特點(diǎn)[5];居于南方的仡佬族與具有北方起源的彝族有過廣泛的基因溝通[4].調(diào)查表示清楚，貴州水族群體在睫毛、拇指類型、中指毛3對(duì)遺傳性狀基因頻率與同地區(qū)的苗族有顯著性差異[6].水族和仡佬族人群在地中海貧血、6-磷酸葡萄糖脫氫酶〔G6PD〕缺乏癥等單基因遺傳性疾病及高血壓和糖尿病等復(fù)雜疾病的發(fā)病和流行等方面具有自個(gè)的特點(diǎn)。EBV能夠使外周血B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和分裂，成為永生性類淋巴母細(xì)胞，這一方式方法已被國內(nèi)外廣泛用于各民族和群體的基因組保存[7].近年來多個(gè)采用全基因組測序方式方法的研究表示清楚，EBV轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞〔LCLs〕基因組與供體外周血細(xì)胞的基因組之間的差異非常微小，尤其是使用低代次的永生細(xì)胞將不會(huì)在遺傳多樣性和臨床疾病關(guān)聯(lián)基因等分析研究中產(chǎn)生有影響的偏差[7].永生化的細(xì)胞株不僅能夠提供取之不竭的DNA,還能提供RNA和蛋白質(zhì)，并且由于具有活細(xì)胞的特性，還能夠用于研究基因的功能、micoRNA及基因表示出調(diào)控及代謝途徑[8],同時(shí)還是研究病毒-宿主互相作用、藥物及其敏感/耐藥基因挑選、抗體和疫苗研究及干細(xì)胞研究等領(lǐng)域的重要材料[9-10].采用EB病毒轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞的方式方法已經(jīng)建立多年，方式方法得到不斷優(yōu)化和完善，關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)包括從采集血液到施行細(xì)胞轉(zhuǎn)化的間隔時(shí)間、所需外周血體積、抗凝劑使用、T淋巴細(xì)胞消除等[11-13].本研究主要參照中國不同民族永生細(xì)胞庫建立的技術(shù)步驟[1],成功建立了253個(gè)水族和仡佬族人永生細(xì)胞株，轉(zhuǎn)化成功率分別為95.8%和92.7%,未轉(zhuǎn)化成功的樣本多與所獲血液量少、血液樣本抗凝不充分而出現(xiàn)細(xì)胞凝集等因素有關(guān)。提示獲得足夠、新鮮血液樣本以保證足夠的淋巴細(xì)胞活性和數(shù)目是轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素之一。永生細(xì)胞株的建立還只是細(xì)胞庫的初期工作，還需對(duì)所建立細(xì)胞株進(jìn)行進(jìn)一步、持續(xù)性的質(zhì)量檢測和細(xì)胞生物學(xué)特性分析，如染色體穩(wěn)定性、端粒酶活性、B淋巴細(xì)胞外表特異性分子標(biāo)記及B細(xì)胞亞群分析等，以提供更多基礎(chǔ)科學(xué)數(shù)據(jù)和確保后續(xù)使用的可靠性。以下為參考文獻(xiàn)[1]褚嘉佑，徐玖瑾，傅松濱，等。中華民族永生細(xì)胞庫的建立[J].國際遺傳學(xué)雜志，2008,31〔4〕:8-25.[2]劉烜，單可人，齊曉嵐，等。貴州布依族、仡佬族、么佬族、毛南族、壯族y-snp的初步研究[J].遺傳，2006,28〔11〕:1350-1354.[3]任光祥，段書剛，余躍生，等。黔南布依族、苗族和水族人群ABO血型分布及基因頻率[J].人類學(xué)學(xué)報(bào)，2007,〔4〕:325-328.[4]LiB,ZhongF,YiH,etal.GeneticpolymorphismofmitochondrialDNAinDong,Gelao,Tujia,andYiethnicpopulationsfromGuizhou,China[J].JGenetGenomics,2007,34〔9〕:800-810.[5]余躍生，姚永剛，孔慶鵬，等。貴州水族人群線粒體DNA序列多態(tài)分析[J].遺傳學(xué)報(bào)，2001〔8〕:691-698.[6]張慶忠，陸玉炯，宋國琴，等。貴州苗族、水族10對(duì)遺傳性狀的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