基因定位常用的方法

關于基因定位常用的方法1第一頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日2

明確幾個基本概念基因：DNA的功能片段?；蚪M：有機體全部DNA序列（它包括基因外的非基因DNA序列），它是基因和非基因DNA序列的總和?；蚨ㄎ唬菏怯靡欢ǖ姆椒▽⒒虼_定到染色體的實際位置。第二頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日3遺傳做圖：是以研究家族的減數(shù)分裂，以了解兩個基因分離趨勢為基礎來繪制基因座位間的距離，它表明基因之間連鎖關系和相對距離，并以重組率來計算和表示，以厘摩（cM）為單位。染色體定位：只把基因定位到某條染色體上。細胞水平上的基因圖又稱細胞遺傳圖區(qū)域定位：從細胞遺傳學水平，用染色體顯帶等技術在光學顯微鏡下觀察，將基因定位到染色體的具體區(qū)帶。第三頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日4一、基因定位的方法1、體細胞雜交法基因定位：體細胞：即生物體除生殖細胞外的任一細胞。1）體細胞雜交的概念：也稱細胞融合（cellinfusion），是將來源不同的兩種細胞融合成一個新細胞。新產(chǎn)生的細胞稱雜種細胞（hybridcell），含雙親不同的染色體。第四頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日5

2）對象：人的細胞鼠類：大鼠、小鼠、倉鼠

3）雜種細胞的特點：在繁殖傳代過程中，人的染色體優(yōu)先丟失，以至最后只剩幾條或一條人的染色體，而嚙齒類的染色體被保留下來。第五頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日64）原理：細胞進行融合時，培養(yǎng)液中只有部分細胞融合成雜種細胞，還有大量未融合的雙親細胞。這就需要選擇分離純化雜種細胞。為此要創(chuàng)造一種只讓雜種細胞生長繁殖而親本細胞死亡的環(huán)境。這就要利用雜種細胞和親本細胞對生長條件的要求和代謝的差異來進行選擇。其中最常用的是HAT選擇系統(tǒng)。第六頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日7HAT選擇系統(tǒng)：

人的突變細胞株：缺乏HGPRT酶小鼠細胞株：缺乏TK酶兩者融合培養(yǎng)于HAT培養(yǎng)基中

HAT培養(yǎng)基：

H為次黃嘌呤，是HGPRT的底物，為DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料）

A可阻斷正常的DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑制）

T在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，為DNA合成提供原料第七頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日8因此在HAT培養(yǎng)基上

人細胞：①由于A的存在，正常的DNA合成通路受阻。②同時由于HGPRT的缺乏，無法利用次黃嘌呤通過旁路合成DNA（嘌呤合成障礙）

第八頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日9鼠細胞：由于A的存在正常的DNA合成通道受阻，有HGPRT可以利用次黃嘌呤合成腺嘌呤，鳥嘌呤，但由于無TK，無法合成胸腺嘧啶。（嘧啶合成障礙）

雜種細胞：有HGPRT旁路合成腺嘌呤,鳥嘌呤；并可以利用TK合成胸腺嘧啶（嘌呤和嘧啶都可以正常合成）

第九頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日10

將篩選出來的雜種細胞轉移到正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，由于人和鼠都有各自不同的生化和免疫學特性，Miller等運用體細胞雜交并結合雜種細胞的特征，證明雜種細胞的存活需要胸苷激酶（TK）。凡是含有人17號染色體的雜種細胞都因有TK活性而存活，反之則死亡，從而推斷TK基因定位于17號染色體上，這是首例應用體細胞雜交法進行的基因定位。第十頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日11第十一頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日12②克隆嵌板法(clonepanelmethod)

根據(jù)不同雜種細胞保留或丟失的人染色體有時是重疊的情況,設計的一種簡便而實用的基因定位方法。

克隆嵌板

雜種克隆保留的人染色體

12345678A++++----B++--++--C+-+-+-+-第十二頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日132.原位雜交和熒光原位雜交

1）原位雜交（insituhybridization）：是最直接的基因定位方法之一，是分子生物學技術在基因定位中的應用，胰島素基因用此方法定位于11p15。

2）原理：堿基的互補配對，同源的DNA-DNA雙鏈或DNA-RNA雙鏈在一定條件下能結合成雙鏈。用放射性或非放射性物質(zhì)標記的DNA、RNA或與mRNA互補的cDNA作探針，可檢測細胞基因組中的同源部分。第十三頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日143）原位雜交的特點：雜交在載玻片上的中期染色體上進行，而不是在溶液和膜上進行。所謂原位是指在標本上DNA原位變性，再與放射性或非放射性物質(zhì)（通常用3H）標記的已知核酸探針雜交，通過放射自顯影來檢測染色體上特異DNA或RNA順序，用放射性顆粒在某條染色體的區(qū)帶出現(xiàn)的最高頻率或熒光的強度來確定探針的位置，從而準確地進行基因定位。第十四頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日154）原位雜交的步驟

制備中期染色體

DNA原位變性

變性放射性或非放射性標記探針

雜交（在載玻片上）

洗膜

放射性標記：放射自顯影

檢測非放射性標記：熒光染料與抗體或蛋白結合記錄雜交信號結合染色體形態(tài)進行基因定位第十五頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日165）熒光原位雜交

（florescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）

用特殊熒光素（dig或Biotin）標記探針DNA（Nicktranslation標記法），變性成單鏈后與變性后的染色體或細胞核靶DNA雜交。在熒光顯微鏡下觀察并記錄結果。FISH優(yōu)點：可用來作基因或特定DNA片段的染色體區(qū)域定位。缺點：必須在已知探針的情況下方可進行。第十六頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日17單色FISH第十七頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日18

多色FISH第十八頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日193.連鎖分析（Linkageanalysis）1）概念：基因定位的連鎖分析是根據(jù)基因在染色體上呈直線排列，不同基因相互連鎖成連鎖群的原理，即應用被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標記相連鎖的特點進行定位。第十九頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日202）重組值（recombinationfraction）是基因定位時兩個基因間遺傳圖距的量度，即基因間的遺傳距離。如果兩個基因間有1%的重組值，其遺傳圖的距離為1厘摩。（centimorgan，cM）3）遺傳標記（geneticmarker）用連鎖分析發(fā)法進行基因定位需要已知的記憶內(nèi)作為遺傳標記，這些標記按孟德爾方式遺傳，標記位點應是多態(tài)的。第二十頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日21第二十一頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日22致病基因和標記座的連鎖第二十二頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日23遺傳多態(tài)性：是指在一個遺傳座位上具有一個以上的等位基因，且各個等位基因在群體中出現(xiàn)的頻率皆高于1%。常用的遺傳標記：

①ABO血型蛋白多態(tài)

②血清蛋白泳動學改變

③HLA

④RFLP小衛(wèi)星DNA：VNTR6-12個核苷酸DNA多態(tài)

⑤VNTR微衛(wèi)星DNA：STR2-6個的VNTR

⑥SNPs第二十三頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日24

二、基因克隆致病基因克隆有兩種基本策略功能克隆定位克隆

1、功能克隆(functionalcloning)

是利用疾病已知的遺傳損傷而引起的生化功能如蛋白質(zhì)氨基酸缺陷的信息,進行基因定位,進而克隆該基因.

第二十四頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日252、定位克隆(positionalcloning)

是先進行基因定位作圖,然后找到來自該定位區(qū)的基因并進行克隆,在此之后才能明確該基因的功能.

功能克隆和定位克隆的比較:

在傳統(tǒng)的功能克隆中,基因功能的研究先于基因鑒定.在定位克隆中,基因定位在先,最后再鑒定基因.基因已鑒定后,可以進行基因功能的選擇性研究.

第二十五頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日26第二十六頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日27

定位克隆鑒定的第一批基因利用了特定基因座的染色體畸變，Duchenne肌營養(yǎng)不良(DMD)基因的克隆是一個重要的例子。第二十七頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日28假肥大型肌營養(yǎng)不良癥(DMD/BMD)

由于抗肌萎縮蛋白(dystrophin)遺傳性缺陷所致的進行性肌萎縮的致死性神經(jīng)肌肉性遺傳病,發(fā)病率為1/3500，XR遺傳。

主要癥狀:通常3---5歲發(fā)病,開始走路不穩(wěn),鴨型步態(tài),上樓梯困難,Gower征陽性.進行性肌萎縮伴有腓腸肌假性肥大,10多歲下肢癱,一般在20多歲之前死于心衰或呼吸衰竭.第二十八頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日29DMD基因克隆的方法

研究者們通過對幾個女性患者的細胞遺傳學研究發(fā)現(xiàn)每個病例受累的常染色體不同但在X染色體上的斷裂點總是p21。同時一個無任何遺傳缺陷家族史的男孩被發(fā)現(xiàn)患有DMD等4種X連鎖隱性遺傳病，在這個獨一無二個體的引發(fā)下，經(jīng)過仔細的遺傳學研究，最終發(fā)現(xiàn)了Xp21.1的微小缺失。第二十九頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日30DMD女性患者的核型第三十頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日31X染色體與常染色體易位時X染色體失活的結果第三十一頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期日32兩個研究