基因工程中常用的酶

關于基因工程中常用的酶第一頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日一、限制性核酸內切酶二、連接酶三、聚合酶四、修飾酶第二頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日基因的剪刀----------------限制性內切酶第一節(jié)限制性核酸內切酶

(Restrictionenzyme)第三頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日核酸酶（P41-42)：切割相鄰的兩個核苷酸殘基間的磷酸二酯鍵導致多核苷酸鏈共價鍵斷裂的一類水解酶?？煞譃楹颂呛怂崦概c脫氧核糖核酸酶。按水解斷裂核酸分子的不同方式分：核酸外切酶：以核酸的末端為酶解部位逐個降解核苷酸核酸內切酶：從核酸內部水解磷酸二酯鍵使之斷裂限制性核酸內切酶，簡稱限制酶第四頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日

一.限制與修飾發(fā)展史:

1962年Arber,W.(瑞士)等提出限制與修飾假說。1968Meselson和Yuan發(fā)現(xiàn)Ⅰ型限制性酶。1968Smith和Wilcox發(fā)現(xiàn)了Ⅱ類限制性酶并闡明其性質。1971Nathans等首次制作酶切圖譜。

因他們發(fā)現(xiàn)了限制性酶并應用于分子遺傳學而獲1978年度諾貝爾生理學和醫(yī)學獎。

第五頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日1962,Arber,1968Smith等發(fā)現(xiàn)限制性酶W.Arber(1929–)H.O.Smith(1931－)BiozentrumderUniversit?tBasel,JohnsHopkinsUniversitySchoolSwitzerlandofMedicine,USA第六頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日寄主控制的限制與修飾作用：第七頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日感染過A菌的噬菌體進入B幾乎總是被切成小片斷的現(xiàn)象，稱限制。寄主使它再次感染時能夠有效生長而沒有收到限制的現(xiàn)象，稱修飾。

第八頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日二.限制性內切酶的類型（P44）基因工程中最常用的是Ⅱ型酶第九頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日二.Ⅱ型酶的命名,書寫與剪切方式：限制酶來源剪切方式EcoRIEscherichiacoliRY13G↓AATTCPstI Providenciastuartii164

CTGCA↓GBseⅡBacilusstearothermophilusstrain822(HpaⅠ)

GTT↓AAC EcoRⅠ(E：屬名；co：種名；R：株；Ⅰ：發(fā)現(xiàn)次序)第十頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日ClaⅠNcoⅠNdeⅠNotⅠSacⅠXbaⅠXhoⅠ有些內切酶來源于無菌株名的細菌第十一頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日Ⅱ型內切酶識別位點序列中心對稱

5‘GAATTC3’3‘CTTAAG5’EcoRⅠ第十二頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日酶切位點及酶切未端平未端5‘GATATC3’3‘CTATAG5’EcoRⅤ5‘GATATC3’3‘CTATAG5’第十三頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日EcoRⅤ(5’···GAT^ATC···3’)HincⅡ(5’···GT(T/C)^(A/G)AC···3’)HindⅡ(5’···GT(T/C)^(A/G)AC···3’)ScaⅠ(5’···AGT^ACT···3’)SmaⅠ(5’···CCC^GGG···3’)第十四頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日具5‘突出未端的粘性未端5‘GAATTC3’3‘CTTAAG5’5‘G3’5’AATTC3’3‘CTTAA5’3’G5’EcoRⅠ第十五頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日BamHⅠ(5’···G^GATCC···3’)EcoRⅠ(5’···G^AATTC···3’)HindⅢ(5’···A^AGCTT···3’)NcoⅠ(5’···C^CATGG···3’)NdeⅠ(5’···CA^TATG···3’)NotⅠ(5’···GC^GGCCGC···3’)SalⅠ(5’···G^TCGAC···3’)XbaⅠ(5’···T^CTAGA···3’)XhoⅠ(5’···C^TCGAG···3’)第十六頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日具3’突出未端的粘性未端5‘GAGCTC3’3‘CTCGAG5’5‘GAGCT3’5’C3’3‘C5’3’TCGAG5’SacⅠ第十七頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日KpnⅠ(5’···GGTAC^C···3’)PstⅠ(5’···CTGCA^G···3’)SacⅠ(5’···GAGCT^C···3’)第十八頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日識別同一序列且在同一位置(有時不)切割DNA的內切酶稱為同裂酶HincⅡ(5’···GT(T/C)^(A/G)AC···3’)

HindⅡ(5’···GT(T/C)^(A/G)AC···3’)SmaⅠ(5’···CCC^GGG···3’)

XmaⅠ(5’···C^CCGGG···3’)同裂酶第十九頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日來源和識別都不同，但酶切產(chǎn)生相同末端的內切酶稱為同尾酶專指產(chǎn)生粘性未端的內切酶同尾酶第二十頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日5‘GGATCC3’3‘CCTAGG5’BamHⅠ5‘G3’3‘CCTAG5’5‘AGATCT3’3‘TCTAGA5’BglⅡ

5‘GATCT3’

3‘A5’T4DNALigase5‘G3‘CCTAGGATCT3’A5’

連接處不再是內切酶識別序列第二十一頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日

BamHⅠ/BglⅡ

SalⅠ/XhoⅠ

SpeⅠ/XbaⅠ第二十二頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日三、限制酶的識別序列與DNA的切割（P47）1、限制酶的識別序列與DNA的來源無關，不具有種的特異性；2、限制酶識別序列的長短涉及對DNA分子切割的頻率，可以從理論上推導酶切DNA片段的大??；作用于同一種DNA分子，識別序列短的出現(xiàn)概率大，酶切DNA片段小。識別位點：4個堿基：44=256

6個堿基：46=4096

第二十三頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日3、限制酶識別序列的相鄰序列效應（P48）：即大多數(shù)限制性內切酶對只含識別序列的寡核苷酸沒有催化活性，需在兩側各延長一個或幾個核苷酸才能被有效酶切。應用：設計引物時加保護堿基。第二十四頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日4、限制酶的位點偏愛性(p48):限制性核酸酶的切割效率與酶切位點側翼序列的核苷酸組成有關。這是一些限制性內切酶酶切效率不高的原因。例如：在實驗過程中，經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)HindIII、XbaI等酶活性較低。應用：涉及局部消化時應考慮使用這些酶。例如，構建基因組文庫時，需要對基因組DNA進行不完全酶切。第二十五頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日5、星活性(P48)正常條件下EcoRⅠ識別5‘-GAATTC-3’,當處于低鹽(<50mmol/L)、高pH(>8.0)或高甘油(50%)時識別5‘-AATT-3’；星活性是指某些限制性核酸內切酶在不適的環(huán)境中其識別序列發(fā)生改變的現(xiàn)象。第二十六頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日四.影響限制性核酸內切酶活性的因素(P49)

1底物DNA的純度在DNA制劑中的某些物質，如蛋白質、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸（EDTA）、SDS（十二烷基硫酸鈉）、以及高濃度的鹽離子等，都有可能抑制核酸內切酶的活性。

第二十七頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日解決辦法：A.增加限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高達10單位甚至更多些。B．擴大酶催化反應的體積，以使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳南♂?。C．延長酶催化反應的保溫時間。第二十八頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日2底物DNA的甲基化程度解決辦法：

更換缺失了甲基化酶的菌株選擇同裂酶第二十九頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日3酶切消化反應的溫度一般內切酶的反應溫度為37℃特例：SmaI:25℃

TaqI:65℃

MaeI:45℃第三十頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日4酶切緩沖液成分：MgCl2、Tris-HCl、β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）以及牛血清蛋白（BSA）

酶活性的正常發(fā)揮，是絕對地需要二價的陽離子，通常是Mg2+。Tris-HCl的作用，在于使反應混合物的PH恒定在酶活性所要求的最佳數(shù)值的范圍之內。疏基試劑對于保持某些限制酶的穩(wěn)定性可能是有用的，但它同樣也可能有利于潛在污染雜質的穩(wěn)定性。有一部分限制酶對于鈉離子或鉀離子濃度變化反應十分敏感，而一部分限制酶則可適應較廣的離子強度變化幅度。

操作中注意事項：合適的溫度；內切酶的用量不超酶切總體積的1/10第三十一頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日酶切反應酶(多數(shù)已商品化,以10u/l溶液形式提供)反應緩沖液(以5倍或10倍母液隨酶提供)反應時間:隨DNA及酶用量而定,一般數(shù)小時至過夜第三十二頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)DNA連接酶

第三十三頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日核酸酶是“剪刀”連接酶就是“漿糊”、“膠水”第三十四頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日一.連接酶(DNAligase)

在E.coli和動植物細胞中都有此酶。能催化DNA中相鄰的3`-OH和5`-P之間形成磷酸二脂鍵。(P51)

第三十五頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日連接酶的功能：(1)能封閉DNA雙鏈或RNA/DNA雜種雙鏈中的單鏈缺口，而不能封閉雙鏈RNA中的單鏈缺口(2)能封閉粘性末端退火后出現(xiàn)的缺口；DNA連接酶是封閉雙螺旋DNA骨架上的缺口（nick）,而不能封閉裂口（gap）。

用途：(1)通過粘端連接DNA分子；(2)連接平端雙鏈DNA分子或平端DNA與人工接頭的連接。第三十六頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日基因工程的操作過程切接轉增檢第三十七頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日１．DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)

1967年，世界上有數(shù)個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)了一種能夠催化在2條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶，即DNA連接酶(1igase)。

這種酶需要在一條DNA鏈的3，—末端具有一個游離的羥基(—OH)，和在另一條DNA鏈的5，—末端具有一個磷酸基團(—P)，只有在這種情況下，才能發(fā)揮其連接DNA分子的功能作用第三十八頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日在大腸桿菌及其它細菌中，DNA連接酶催化的連接反應，是利用ＮＡＤ＋[煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)]作能源的；而在動物細胞及噬菌體中，則是利用ATP[腺苷三磷酸]作能源。DNA連接酶并不能夠連接兩條單鏈的DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子，被連接的ＤＮＡ鏈必須是雙螺旋的一部分。實際上，DNA連接酶是封閉雙螺旋DNA骨架上的缺口(nick)，即在雙鏈DNA的某一條鏈上兩個相鄰核苷酸之間失去一個磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈斷裂。第三十九頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日第四十頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日第四十一頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日分類：

用于共價連接DNA限制片段的連接酶有兩種不同的來源：一種是由大腸桿菌染色體編碼的叫做DNA連接酶。另一種是由大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼的叫做T4DNA連接酶。

這兩種DNA連接酶，除了前者用NAD+作能源輔助因子，后者用ATP作能源輔助因子外，其它的作用機理并沒有什么差別。第四十二頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日

連接酶連接缺口DNA的最佳反應溫度是37℃。但是在這個溫度下，粘性末端之間的氫鍵結合是不穩(wěn)定的。因此，連接粘性末端的最佳溫度，應是界于酶作用速率和末端結合速率之間，一般認為４－１6℃比較合適．第四十三頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日３．粘性末端DNA片段的連接

3.1粘性末端的連接

DNA連接酶最突出的特點是，它能夠催化外源DNA和載體分子之間發(fā)生連接作用，形成重組的DNA分子。應用DNA連接酶這種特性，可在體外將具有粘性末端的DNA限制片段，插入到適當?shù)妮d體分子上，從而可以按照人們的意圖構建出新的DNA雜種分子。具粘性末端的DNA片段的連接比較容易，也比較常用。第四十四頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日第四十五頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日3.2平末端DNA片段的連接

不具有粘性末端的DNA分子也可以被連接起來。連接這種平末端DNA分子的方法有4種，（1）直接用T4DNA連接酶連接；（2）先用末端核苷酸轉移酶，給平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA連接酶進行連接；（3）用銜接物連接平末端DNA分子；（4）DNA接頭連接法。第四十六頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日（1）直接用T4DNA連接酶連接

T4DNA連接酶除了能夠封閉具有3，一OH和5’一P末端的雙鏈DNA的缺口之外，在存在ATP和加入高濃度酶的條件下，它還能夠連接具有完全堿基配對的平末端的DNA分子。這種反應的原因目前尚不清楚。但平末端連接效率不高。

第四十七頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日（2）同聚物加尾連接平末端DNA片段

運用末端核苷酸轉移酶，能夠將核苷酸(通過脫氧核苷三磷酸前體)，加到DNA分子單鏈延伸末端的3，一OH基團上，它并不需要模板鏈的存在，它一個一個加上核苷酸，構成由核苷酸組成的尾巴，長度可達100個核苷酸。

第四十八頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日(3)用銜接物連接平末端DNA分子

如果重組體DNA是用T4DNA連接酶的平末端連接或是用同聚物加尾構建的，那么就無法用原來的限制酶作特異的切割，因此也不能獲得插入DNA片段。為了解決這個問題，可采用銜接物法提供必要的序列，進行DNA分子的連接。所謂銜接物(1inker)

，是指用化學方法合成的一段由10—12個核苷酸組成的、具有一個或數(shù)個限制酶識別位點的寡核苷酸片段。

第四十九頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日（4）DNA接頭連接法

DNA銜接物連接法盡管有諸多方面的優(yōu)越性，但也有一個明顯的缺點，那就是如果待克隆的DNA片段或基因的內部，也含有與所加的銜接物相同的限制位點，這樣在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時，也就會把克隆基因切成不同的片段，從而為后繼的亞克隆及其它操作造成麻煩。當然，在遇到這種情況時，一個方法可改用其它類型的銜接物，另一種公認的較好的替代辦法是改用DNA接頭(adapter)連接法。

第五十頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日DNA接頭(adapter)連接法于1978年由康乃爾大學吳瑞教授發(fā)明的。它是一類由人工合成的一頭具有某種限制性內切酶粘末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸片段。當它的平末端與平末端的外源DNA片段連接之后，便會使后者成為具粘性末端的新的DNA分子，而易于連接重組。

第五十一頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日第五十二頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日第三節(jié).DNA聚合酶類DNA聚合酶：催化以DNA為模板合成DNA的反應.特點:(1)以dNTPs作底物；

(2)有模板存在；

(3)有引物存在；

(4)新鏈合成方向為5’—3’第五十三頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日第五十四頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日

一分子的核苷酸的3’-位羥基與另一分子核苷酸的5’-位磷酸基通過脫水可形成3’,5’-磷酸二酯鍵，從而將兩分子核苷酸連接起來。

第五十五頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日多核苷酸鏈：核酸就是由許多核苷酸單位通過3’,5’-磷酸二酯鍵連接起來形成的不含側鏈的長鏈狀化合物。核酸具有方向性的長鏈狀化合物，多核苷酸鏈的兩端，一端稱為5’-端，另一端稱為3’-端。第五十六頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日1、DNA聚合酶I(DNApolymeraseI)DNApolI單鏈多肽，MW＝109kD,可被枯草桿菌蛋白酶切成兩段：C-端大片斷(Klenow酶)，MW＝67kD,具5`→3`聚合酶和3`→5`外切酶活性N-端小片斷MW＝35kD,具5`→3`外切酶活性。(一)聚合酶活性：Mg2+DNA＋ndNTPsDNA－(pdN)n+nPPi5`CCGOH

Mg2+5`

CCGATACC

3`GGCTATGG

3`GGCTATGG條件：dNTPs和Mg2+；DNA模板；引物鏈第五十七頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日(二)外切酶活性(2)5`→3`外切酶活性:切補作用從游離的5`端降解DNA，對DNA雙鏈部分的磷酸二脂鍵有切除功能，每次切10nt5`CGCATCTMg2+5`CATCT3`GCGCGTAGA3`GCGCGTAGA(3)3`→5`外切酶活性:校對作用從游離的5`端降解dsDNA和ssDNA5`CGCATCTMg2+5`CGC3`GCG3`GCG第五十八頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日核酸外切酶活性3′→5′外切酶活性5′→3′外切酶活性第五十九頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日2、Klenow聚合酶

5-3端的外切酶活性

5-3端的聚合酶活性3、T4DNA聚合酶

來源于被T4噬菌體感染的大腸桿菌，作用同上4、T7DNA聚合酶來源于被T7噬菌體感染的大腸桿菌，作用同上5、TaqDNA聚合酶耐高溫第六十頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日

6.逆轉錄酶(reversetranscriptase)

以RNA為模板的DNA聚合酶，來源于鼠（MLV）和禽類（AMV）的反轉錄病毒。由兩條肽鏈組成，具有5’→3’聚合酶和RNaseH活性(見P55）。用途：(1)以RNA為模板合成cDNA,作為插入載體的目的基因或構建cDNA文庫；(2)建立反轉錄PCR（RT-PCR)(3)以ssDNA或RNA為模板合成雜交探針。第六十一頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日M-MLV反轉錄酶

1)特點：

依賴于RNA的DNA聚合酶活性；依賴于DNA的DNA聚合酶活性；不具內切酶活性;RNaseH活性低;

2)與AMV反轉錄酶比較

a．合成短鏈cDNA(0.6kb)時，兩者相同，但M-MLV反轉錄酶需要量大，可能與其穩(wěn)定性差有關

b．合成長鏈cDNA(4.5-7.5kb)時，它比AMV反轉錄酶有效得多，這與它無內切酶活性有關。

3)用途

a.cDNA合成用于文庫建立;b.制備cDNA探針;c.DNA序列分析;d.填補5’-突起末端以獲平端AMV反轉錄酶能夠從DNA-RNA的雜交鏈中特異性地降解RNA鏈，進而保留新合成的DNA鏈。具有RNaseH活性第六十二頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日第六十三頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日第四節(jié)、修飾酶類1、末端轉移酶2、堿性磷酸酶3、S1核酸酶4、T4多核苷酸激酶第六十四頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日末端轉移酶(terminaltransferase)

取自小牛胸腺,催化脫氧核苷酸與DNA的3`-OH結合模板/引物或底物是帶有3`-OH基的ssDNA或帶有突出的雙鏈DNA。不要求有模板。