實(shí)驗(yàn)室及基本操作

關(guān)于實(shí)驗(yàn)室及基本操作第一頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一第一節(jié)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的建立在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)工作之前，首先應(yīng)對(duì)工作中需要哪些最基本的設(shè)備條件有個(gè)全面的了解，以便因地制宜地利用現(xiàn)有房屋，或新建、改建實(shí)驗(yàn)室?！魧?shí)驗(yàn)室的大小取決于工作的目的和規(guī)模

1.以工廠化生產(chǎn)為目的，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模太小，則會(huì)限制生產(chǎn)影響效率。

2.在設(shè)計(jì)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，應(yīng)按組織培養(yǎng)程序來(lái)設(shè)計(jì)，避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。

◆植物組織培養(yǎng)是在嚴(yán)格無(wú)菌的條件下進(jìn)行的，要做到無(wú)菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具，

同時(shí)還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。第二頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一一、組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局的總體要求

便于隔離便于操作便于滅菌便于觀察二、構(gòu)成化學(xué)實(shí)驗(yàn)室（洗滌室）

接種室無(wú)菌培養(yǎng)室滅菌室細(xì)胞學(xué)觀測(cè)室（可以不設(shè)）第三頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一三、主要單元功能介紹接種室(外設(shè)緩沖間)無(wú)菌接種箱1.無(wú)菌操作室材料的消毒、接種，繼代。

內(nèi)置超凈工作臺(tái)或接種箱。

外設(shè)緩沖間，放置拖鞋、工作服、工作帽等。第四頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.培養(yǎng)室滿足材料的生長(zhǎng)（光、熱、水、氣）。

要求：保溫隔熱；控溫、控光；

暗室。

設(shè)備：培養(yǎng)架、加溫設(shè)備、降溫設(shè)備第五頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一3.化學(xué)實(shí)驗(yàn)室

器皿的洗滌、干燥、保存；

藥品稱量、溶解、培養(yǎng)基的配置；植物材料預(yù)處理，培養(yǎng)材料的觀察分析。

主要設(shè)備工作臺(tái)、藥品柜、冰箱、烘箱、天平、蒸餾水器。

第六頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一4.滅菌室對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌。5.細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)材料的分析照相，設(shè)備：顯微鏡、解剖鏡、染色設(shè)備。第七頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一基本實(shí)驗(yàn)室布局平面圖實(shí)驗(yàn)臺(tái)擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及儀器柜無(wú)菌臺(tái)無(wú)菌臺(tái)擱架拉窗冰箱擱架水槽電爐門4.5m3.0m3.5m4.0m準(zhǔn)備室緩沖室無(wú)菌室培養(yǎng)室第八頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一四、常用儀器設(shè)備（一）儀器

1.天平

1/10、1/100藥物天平：大量元素、蔗糖、瓊脂。

1/10000分析天平：維生素、激素、微量元素、微量附加物。

2.滅菌鍋

3.烘箱（干燥箱）

80-100℃：烘干物品、測(cè)定植物組織干物質(zhì)重。

150-160℃：干熱滅菌（不超過(guò)175℃）；第九頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一4.冰箱有機(jī)試劑和母液的儲(chǔ)藏；細(xì)胞及其他材料的冷藏保存；植物材料的處理（低溫打破休眠）。5.酸度計(jì)對(duì)培養(yǎng)基pH值進(jìn)行調(diào)整。（一般用pH4-7的精密試紙代替）第十頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一6.雙筒實(shí)體顯微鏡（解剖鏡）

莖尖的剝?nèi)。ǚ稚M織）；對(duì)植物材料的隔瓶觀測(cè)。7.蒸餾水器減小實(shí)驗(yàn)中的偶然因素。8.空調(diào)溫度變化差異不大。蒸餾水器第十一頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一9.震蕩培養(yǎng)機(jī)和旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)機(jī)液體培養(yǎng)。10.培養(yǎng)箱搖床光照培養(yǎng)箱第十二頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一1.玻璃器皿①培養(yǎng)器皿原則：無(wú)毒透光；試管：2×15，2.5×15，3×15。

三角瓶：50ml，100ml，150ml，200ml。（主要用于繼代培養(yǎng)）培養(yǎng)皿：原生質(zhì)體、游離細(xì)胞、花藥等的培養(yǎng)；無(wú)菌種子的萌發(fā)；材料的分離；無(wú)菌濾紙的消毒滅菌

封閉物防止培養(yǎng)基干燥和杜絕污染、無(wú)毒透氣（棉塞、菌膜）（二）必要器皿第十三頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一②盛裝器皿燒杯、試劑瓶，藥品的溶解和儲(chǔ)存。③計(jì)量器皿

量筒：10ml、25ml、50ml、100ml、200ml、500ml、1000ml。容量瓶：25ml，50ml，100ml，250ml，500ml，1000ml。移液管：0.1ml，0.2ml，1ml，2ml，5ml，10ml。④其他漏斗玻棒滴瓶第十四頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.金屬器皿

鑷子：剪刀：分離器械：手術(shù)刀、芽接刀

第十五頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一大量元素；微量元素；維生素、氨基酸等（有機(jī)附加物）。糖類：蔗糖、葡萄糖等。凝固劑：瓊脂等。激素生長(zhǎng)素類：IAA、IBA、NAA、2，4-D。細(xì)胞分裂素類：6-BA、KT、ZT赤霉素類：GA3（三）常備藥品第十六頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一一、培養(yǎng)基及其配制

（一）概念

培養(yǎng)基：外植體生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

（二）種類

1.根據(jù)水平

基本培養(yǎng)基

大量元素和微量元素、維生素和氨基酸，還有糖和水。

完全培養(yǎng)基

在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，附加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或有機(jī)附加物。

MS+NAA0.2+6-BA2+蔗糖3%+pH5.8第二節(jié)植物組織培養(yǎng)的一般技術(shù)第十七頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一單位：mg/L第十八頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一MSmg/L第十九頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2、根據(jù)成分

◆天然培養(yǎng)基：動(dòng)、植物的組織或組織的汁配成的培養(yǎng)基。

化學(xué)成分還不清楚或不恒定。

生物性液體（血清）；組織浸液（胚胎浸液）；凝固劑（血漿）等。

◆合成培養(yǎng)基：成分、濃度已知。

◆半合成培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基+合成培養(yǎng)基。

3、根據(jù)理化狀態(tài)

液體培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基+凝固劑。第二十頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一4、根據(jù)功能

愈傷組織培養(yǎng)基、花粉培養(yǎng)基、莖尖培養(yǎng)基、

脫分化培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基。1）脫分化培養(yǎng)基（mg/L）高濃度生長(zhǎng)素?zé)煵荩篗S+水解蛋白500+2,4-D1-2。水稻：MS+2,4-D1。多量生長(zhǎng)素+少量細(xì)胞分裂素?zé)熑~：MS+水解蛋白500+2,4-D2+KT0.25

哈密瓜：Miller+NAA2+KT0.5多量細(xì)胞分裂素+少量生長(zhǎng)素天竺葵：MS+NAA0.2+6-BA2第二十一頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2）繼代培養(yǎng)基

在脫分化培養(yǎng)基上降低生長(zhǎng)素的量、

或用原脫分化培養(yǎng)基。

3）生根培養(yǎng)基

只用基本培養(yǎng)基；

加生長(zhǎng)素：菠蘿：MS+IAA0.3

加細(xì)胞分裂素：哈密瓜：Miller+KT0.5

半量法第二十二頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一（三）培養(yǎng)基成分功能組成各種化合物，參與機(jī)體的建成，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)。構(gòu)成一些生理活性物質(zhì)，參與活躍的新陳代謝。元素之間互相協(xié)調(diào)，以維持離子濃度的平衡、膠體穩(wěn)定、電化學(xué)平衡等作用。注：不同器官的發(fā)生，需要營(yíng)養(yǎng)元素的濃度不同。第二十三頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一1.無(wú)機(jī)鹽大量元素：碳、氫、氧、氮、磷、鉀、鈣、鎂、硫、硅（-）

。

3+7種，干重0.01-10%微量元素：鐵、硼、錳、鋅、銅、鉬、氯、鎳（-）

、鈉（-）。

9種，干重0.00001-0.01%I（+）、Co（+）。必需元素的生理作用，略。第二十四頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.有機(jī)物1）維生素：B1（鹽酸硫胺素）、B3（煙酸）、B6（鹽酸吡哆醇）。維生素主要是以各種輔酶的形式參加酶的形成，以及蛋白質(zhì)、脂肪的代謝等重要生命活動(dòng)。對(duì)生長(zhǎng)和分化有促進(jìn)作用。雖然大多數(shù)的植物細(xì)胞在培養(yǎng)中都能合成所必需的維生素，但在數(shù)量上還明顯不足，通常需加入1至數(shù)種維生素，以便獲良好的生長(zhǎng).。第二十五頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2）氨基酸

氨基酸是蛋白質(zhì)的組成成分，也是一種有機(jī)氮源，可直接被細(xì)胞吸收利用。常用的有甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、丙氨酸以及酰胺類物質(zhì)（如天門冬酰胺）和多種氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋白等）。用酶法等加工牛乳的水解產(chǎn)物，由于營(yíng)養(yǎng)豐富，極易引起污染。如在培養(yǎng)中無(wú)特別需要，以不用為宜。第二十六頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一3）肌醇肌醇具有幫助活性物質(zhì)（VB1）發(fā)揮作用的效果，能使培養(yǎng)物快速生長(zhǎng)，對(duì)胚狀體和芽的形成有良好的促進(jìn)作用。4）天然有機(jī)附加物大多含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物。它對(duì)細(xì)胞和組織的增殖與分化有明顯的促進(jìn)作用，但對(duì)器官的分化作用不明顯。它的成分大多不清楚，與其成熟度及產(chǎn)地關(guān)系也很大，所以一般應(yīng)盡量避免使用。

第二十七頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一椰乳：是使用最多、效果最好的一種天然復(fù)合物。它在愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)中有促進(jìn)作用。在馬鈴薯莖尖分生組織和草莓微莖尖培養(yǎng)中起明顯的促進(jìn)作用。香蕉：用黃熟的小香蕉，加入培養(yǎng)基后變?yōu)樽仙?，?duì)pH值的緩沖作用大。主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應(yīng)用。馬鈴薯：去掉皮和芽后，加水煮，再經(jīng)過(guò)過(guò)濾，取其濾液使用。對(duì)pH值緩沖作用也大。酵母提取液：主要成分為氨基酸和維生素類。其他，麥芽提取液、蘋果和番茄的果汁、黃瓜的果實(shí)、未熟玉米的胚乳等。遇熱較穩(wěn)定，大多在培養(yǎng)困難時(shí)使用，有時(shí)有效。

第二十八頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一3.碳源為細(xì)胞提供合成新化合物的碳骨架，為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物與能源，還可以維持一定的滲透壓。最常用的碳源是蔗糖。葡萄糖和果糖也是較好的碳源，麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用。濃度：2%-4%，最常用3%

。在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可用食用的白糖代替。第二十九頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一4.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑1）生長(zhǎng)素類誘導(dǎo)細(xì)胞脫分化，促進(jìn)愈傷組織的形成；促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂；促進(jìn)生根?！暨胚嵋宜幔杭に?，有利于根形成，但是它容易被氧化和光解，組織培養(yǎng)中通常使用合成的生長(zhǎng)素?！暨胚岫∷幔赫T導(dǎo)許多植物生根。◆萘乙酸：最適宜誘導(dǎo)愈傷組織或誘導(dǎo)某些外植體生根。◆二氯苯氧乙酸（2,4-D）：引起脫分化。能夠引起染色體變異，因此使用時(shí)必須格外小心。第三十頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一作用效力吲哚乙酸（IAA）吲哚丁酸（IBA）萘乙酸（NAA）二氯苯氧乙酸（2,4-D）第三十一頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2）細(xì)胞分裂素類促進(jìn)細(xì)胞分化；有利于細(xì)胞分裂和愈傷組織的形成；促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大，可使莖增粗，而抑制莖的伸長(zhǎng)；誘導(dǎo)芽的分化，促進(jìn)側(cè)芽發(fā)生?！艏?dòng)素：最主要的用途是誘導(dǎo)芽的形成。

◆玉米素：是一種天然激素，價(jià)格昂貴，其作用稍差于芐氨基嘌呤。6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）：具有高效、穩(wěn)定、廉價(jià)和易于使用等特點(diǎn)，是組織培養(yǎng)最常用細(xì)胞分裂素類。主要作用是促進(jìn)芽的形成，也可以誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生。第三十二頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一作用效力玉米素ZT6-芐氨基腺嘌呤6-BA激動(dòng)素KT腺嘌呤第三十三頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一3）赤霉素

赤霉素有127種，生理活性及作用的種類、部位、效應(yīng)等各有不同，培養(yǎng)基中添加的是GA3，主要用于促進(jìn)幼苗莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，促進(jìn)胚狀體發(fā)育成小植株。第三十四頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一5.培養(yǎng)材料的支持物

瓊脂固體培養(yǎng)時(shí)瓊脂是最好的固化劑。瓊脂的用量在0.8-1.0%之間。凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關(guān)外，還與高壓滅菌時(shí)的溫度、時(shí)間和pH值等因素有關(guān)。其它：玻璃纖維、濾紙橋、海綿、卡拉膠等。第三十五頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一6、其他成分抗生素物質(zhì)：有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等,

可防止菌類污染，減少培養(yǎng)中材料的損失?？寡趸瘎阂缀只牟牧稀；钚蕴浚呵o尖初代培養(yǎng)，加入適量活性炭，可以吸附外植體產(chǎn)生的致死性褐化物；新梢增殖階段，活性炭可明顯促進(jìn)新梢的形成和伸長(zhǎng)；活性炭在生根時(shí)有明顯的促進(jìn)作用。

7、pH值喜光、耐旱、耐鹽堿：pH值中性；喜濕、耐陰、喜酸：pH值偏酸。培養(yǎng)基滅菌后，pH值一般下降。第三十六頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一（四）培養(yǎng)基的選擇幾種基本培養(yǎng)基的特點(diǎn)1）富集元素平衡培養(yǎng)基---MS培養(yǎng)基（典型代表）

無(wú)機(jī)鹽濃度高，元素間的比例較適合；

緩沖性能好，某些元素略有損失不會(huì)影響離子平衡；

營(yíng)養(yǎng)豐富，不需再加入水解蛋白等有機(jī)成分；

微量元素種類較全，濃度較高；適合多種植物，用途廣泛。與MS相類似的培養(yǎng)基，

LS、BL、BM、ER培養(yǎng)基等。第三十七頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2）硝酸鉀含量較高的培養(yǎng)基

硝酸鉀的含量高，

銨態(tài)氮的含量低，含有較高的鹽酸硫胺素（VB1）。如，B5（水稻成熟胚愈傷組織分化時(shí)用其微量元素部分）、

N6（禾谷類植物的花藥和花粉培養(yǎng)

）、

SH培養(yǎng)基。第三十八頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一3）中等無(wú)機(jī)鹽含量的培養(yǎng)基

大量元素?zé)o機(jī)鹽約為MS的一半；

微量元索種類減少而含量增高；

維生素種類比MS多。

如，H、Nitsch、Miller培養(yǎng)基。

4）低無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)鹽含量很低，一般為MS的1/4；

有機(jī)成分含量也很低；

多用作生根培養(yǎng)基。

如，White

、WS、HE、HB培養(yǎng)基。第三十九頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.培養(yǎng)基選擇

1）背景調(diào)查對(duì)該供試植物分類地位、生理特性、繁殖、栽培條件及品種類型等有充分的了解。應(yīng)詳細(xì)查閱前人對(duì)該植物的研究工作，總結(jié)分析前人工作的成功和不足之處，從而在此基礎(chǔ)上確定基本培養(yǎng)基類型。第四十頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2）選擇原則同一物種的不同亞種、品種間的基本培養(yǎng)基類型基本相同；同一植物的不同組織、器官的基本培養(yǎng)基類型基本相同；營(yíng)養(yǎng)成分需求與田間栽培有相似性；無(wú)機(jī)鹽濃度是基本培養(yǎng)基類型的重要因素，應(yīng)該作為培養(yǎng)基選擇的重要參數(shù)；有機(jī)成分主要是種類的變化，每種成分含量的變化不大；在確定基本培養(yǎng)基類型后，研究最適的蔗糖濃度。第四十一頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一3）激素的選擇原則生長(zhǎng)素主要功能是促進(jìn)細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)愈傷組織和生根等，各種生長(zhǎng)素的強(qiáng)度按以下排列而減弱：

2,4-D、NAA、IBA和IAA。與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)莖的增殖。細(xì)胞分裂素主要促進(jìn)細(xì)胞分裂，改變頂端優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)芽的分化等。常用幾種細(xì)胞分裂素的強(qiáng)度按以下排列減弱；

ZT、6-BA、、KT和腺嘌呤。第四十二頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一激素選擇原則細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比例是激素使用的關(guān)鍵；細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的種類對(duì)不同植物的敏感性不同；同一植物的不同組織在愈傷組織誘導(dǎo)和芽分化過(guò)程中對(duì)激素的要求不同。4）總結(jié)基本培養(yǎng)基生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)糖營(yíng)養(yǎng)元素天然附加物凝固劑第四十三頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一4）常用試驗(yàn)方法單因子試驗(yàn)培養(yǎng)基中其他成分都不變，只變動(dòng)一個(gè)因子。就可以找出這一因子對(duì)試驗(yàn)的影響和影響的程度。多因子試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基中兩個(gè)或兩個(gè)以上因素進(jìn)行研究。試驗(yàn)可采用完全試驗(yàn)方案、正交設(shè)計(jì)方案。第四十四頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一培養(yǎng)基配方試驗(yàn)第四十五頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一（五）培養(yǎng)基的配制1.對(duì)藥品和水的要求

選擇等級(jí)較高的藥品;

同一試驗(yàn)要用同一批次的藥品;

原則上用純水。藥品純度等級(jí)1、工作基準(zhǔn)試劑（無(wú)簡(jiǎn)寫標(biāo)記，用漢語(yǔ)注明，綠色標(biāo)簽）：作為基準(zhǔn)物質(zhì)，標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2、優(yōu)級(jí)純（GR，綠色標(biāo)簽）：用于精確分析和研究工作，有的可作為基準(zhǔn)物質(zhì)。

3、分析純（AR，紅色標(biāo)簽）：用于工業(yè)分析及化學(xué)實(shí)驗(yàn)，用得最多的等級(jí)。

4、化學(xué)純（CP，藍(lán)色標(biāo)簽）：用于化學(xué)實(shí)驗(yàn)和合成制備。

5、實(shí)驗(yàn)試劑（LR，黃色標(biāo)簽）：用于一般化學(xué)實(shí)驗(yàn)和合成制備。第四十六頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.母液配制1）優(yōu)點(diǎn)減少工作量;

減少多次稱量造成的誤差;

便于微量元素的稱量;

保證每一個(gè)材料的培養(yǎng)基有相同的成分。第四十七頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2）母液種類大量元素：10~50倍；微量元素：100~200倍；

Fe鹽：100~200倍（棕色瓶）；有機(jī)物：20~100倍；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑母液（1mg/ml）。第四十八頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一3）母液配制注意事項(xiàng)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的溶解生長(zhǎng)素類：堿溶；

95%乙醇溶、蒸餾水定容。細(xì)胞分裂素類：酸溶、蒸餾水定容。赤霉酸：熱水溶，以95%乙醇配成原液。第四十九頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一Fe鹽制備：將兩物質(zhì)分別溶解在450ml水中，然后混合，定容。配制好的母液分別貼上標(biāo)簽MS大量元素10X查仁明04.04.04貯存：溫度2-4度，一般無(wú)機(jī)物3-6個(gè)月，有機(jī)物3個(gè)月。第五十頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一3、培養(yǎng)基配制蒸餾水→母液→生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑→瓊脂粉→蔗糖→融化→調(diào)節(jié)pH→分裝→滅菌→冷卻第五十一頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、無(wú)菌技術(shù)有菌的范疇凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的表面都是有菌的，包括細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。無(wú)菌的范疇經(jīng)高溫灼燒或一定時(shí)間蒸煮過(guò)后的物體，經(jīng)其他物理的或化學(xué)的滅菌方法處理后的物體，高層大氣、巖石內(nèi)部、強(qiáng)酸強(qiáng)堿，化學(xué)元素滅菌劑等的表面和內(nèi)部等等都是無(wú)菌的。

第五十二頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一污染

指在組織培養(yǎng)過(guò)程中由于真菌、細(xì)菌或病毒的侵染，而使培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。直接侵入培養(yǎng)物中，殺死培養(yǎng)物；向培養(yǎng)基分泌有毒物質(zhì)，毒死培養(yǎng)物；競(jìng)爭(zhēng)培養(yǎng)基養(yǎng)分使?fàn)I養(yǎng)耗盡，培養(yǎng)物饑餓而死。第五十三頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一污染所引起的危害◆污染引起的危害有的是極明顯的，如早期培養(yǎng)的失敗，增殖效率的降低，生長(zhǎng)減慢，玻璃苗增加，生長(zhǎng)的不均勻等；而有的影響可在以后的過(guò)程顯現(xiàn)，如移栽困難和苗的死亡，田間的不良表現(xiàn)?！粑廴疽矔?huì)引起培養(yǎng)物的遺傳變異?！粲行┎≡拇嬖冢ㄈ鐕?guó)際上已發(fā)現(xiàn)的某些商業(yè)生產(chǎn)的試管苗帶有胡蘿卜軟腐歐文氏菌），可以引起多種作物的病害；試管苗（在未進(jìn)行專門的病原體脫除和鑒定時(shí)）也常是很多致病的病毒、類病毒、類菌原體的攜帶者，育目發(fā)展可能引起病毒大規(guī)模的擴(kuò)散。第五十四頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一（一）污染源及其表現(xiàn)特征1.外植體表面帶菌：接種后很快長(zhǎng)出微生物菌落;

內(nèi)生帶菌：接種后一定時(shí)間才表現(xiàn)出來(lái)。特征：靠近外植體培養(yǎng)基表面出現(xiàn)微生物菌落。

2.培養(yǎng)基在培養(yǎng)基表層和深層同時(shí)出現(xiàn)點(diǎn)狀分布的菌落。第五十五頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一3.培養(yǎng)器皿

在培養(yǎng)基與容器接觸處

或器壁上出現(xiàn)菌落。4.工作人員在培養(yǎng)基表面或操作器械接觸處出現(xiàn)菌落。5.空氣原因：超凈工作臺(tái)故障；瓶塞過(guò)松特征：在培養(yǎng)基表面靠近培養(yǎng)容器壁處出現(xiàn)菌落。第五十六頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一（二）常用的滅菌方法滅菌用物理或化學(xué)的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。消毒殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用。第五十七頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一1.加熱滅菌1）濕熱滅菌設(shè)備：高壓滅菌鍋原理：通過(guò)蒸汽接觸材料表面

冷凝時(shí)釋放熱能達(dá)到殺死微生物的目的。工作條件：1-1.2kg/㎝2，20-30min。

121℃，15min。注意事項(xiàng)滅菌前排盡冷空氣；滅菌后壓力切勿降低太快。第五十八頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2）干熱滅菌◆灼燒蘸95%酒精燃燒器具?！艉鏌O(shè)備：烘箱工作條件：140℃，4h

或160-170℃，2-3h注意事項(xiàng)：要妥為包扎，以免滅菌后取用時(shí)重新污染；溫度一般勿超過(guò)175℃第五十九頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.化學(xué)滅菌

1）液體滅菌：酒精、升汞、雙氧水、次氯酸鈉等，適用于外植體表面滅菌。

2）氣體滅菌：甲醛、乙二醇。向甲醛內(nèi)加入高錳酸鉀，促進(jìn)甲醛的快速揮發(fā)而起到滅菌的作用。用于培養(yǎng)室和接種室的滅菌，每立方米用甲醛2毫升，高錳酸鉀1克，

3.紫外輻射滅菌原理：細(xì)菌吸收紫外線后，蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，引起細(xì)菌的染色體變異，造成死亡。用途：紫外線的穿透能力很弱，所以只適于空氣和物體表面的滅菌。4.過(guò)濾滅菌

細(xì)菌濾膜的網(wǎng)孔的直徑為0.45μm以下，當(dāng)溶液通過(guò)濾膜后，細(xì)菌的細(xì)胞和真菌的孢子等因大于濾膜直徑而被阻。第六十頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一（三）無(wú)菌技術(shù)1.接種室

2％新潔爾滅拖洗地面和擦洗墻壁;70-75％乙醇或0.5%苯酚噴霧降塵;40%甲醛熏蒸;

接種前30min用紫外燈進(jìn)行空氣消毒;70%乙醇擦拭工作臺(tái)面。2.試材和器皿的滅菌

1）培養(yǎng)基和無(wú)菌水；

2）不耐熱的物質(zhì)。第六十一頁(yè)，共六十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一3）玻璃器皿及耐熱用具

量大：烘燒法量小：濕熱法4）無(wú)菌操作器械

灼燒法5）外植體

消毒方法涮洗、沖洗外植體