創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)順鉑和阿霉素的濃度對細(xì)胞增殖產(chǎn)生的影響

/創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)論文探究抗腫瘤藥物順鉑和阿霉素的濃度對人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞增殖和凋亡產(chǎn)生的影響姓名：胡爾曼那力·艾力胡加學(xué)號：２年級：20１1級專業(yè)：生物科學(xué)探究抗腫瘤藥物順鉑和阿霉素的濃度對人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞增殖和凋亡產(chǎn)生的影響摘要:本實(shí)驗(yàn)主要探究抗腫瘤藥物順鉑和阿霉素對HeLa細(xì)胞增殖及凋亡的影響，HeLａ細(xì)胞是一種癌細(xì)胞，增殖速度快，通過探究其藥物的濃度對癌細(xì)胞的抑制及其凋亡情況,可以利用藥物有效地控制細(xì)胞的增殖并使細(xì)胞致死.通過ＭTT比色法對HeLａ細(xì)胞進(jìn)行生長曲線的測定，觀察細(xì)胞的生長情況。在生長曲線上找出相應(yīng)的IＣ５０的值，并且比較不同濃度下的IＣ50的值，即可知道藥物的濃度對細(xì)胞增殖所造成的影響。通過流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法測出細(xì)胞的凋亡比例及各個周期時相的百分比即可知道不同藥物對于ＨeLａ細(xì)胞凋亡的影響。前言：細(xì)胞增殖是生物體的重要生命特征,細(xì)胞以細(xì)胞分裂的方式進(jìn)行增殖。通過細(xì)胞分裂，可以將復(fù)制的遺傳物質(zhì)，平均地分配到兩個子細(xì)胞中去.可見,細(xì)胞增殖是生物體生長、發(fā)育、繁殖和遺傳的基礎(chǔ)。細(xì)胞如果增殖異常如無限地增殖,將會導(dǎo)致生物體的正常生命功能受阻，如腫瘤的發(fā)生。細(xì)胞死亡也是生物體的重要生命活動之一。多細(xì)胞生物發(fā)育過程中，在細(xì)胞增殖和分化的同時一些細(xì)胞被選擇性地消除,以形成組織、器官和四肢，而且在整個生命進(jìn)程中,細(xì)胞的死亡與新細(xì)胞的產(chǎn)生之間的動態(tài)平衡對于維持組織和器官的正常功能具有重要作用.因此，細(xì)胞死亡調(diào)控的異常與帕金森癥、自身免疫性疾和癌癥等疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。癌癥是威脅人類健康的最嚴(yán)重的疾病之一,并呈不斷上升趨勢。目前用于癌癥治療的主要手段有手術(shù)、放療、化療和生物治療.腫瘤化學(xué)治療是應(yīng)用一種或數(shù)種化學(xué)藥物，通過口服或注射達(dá)到治療腫瘤的方法。不同腫瘤的化療效果差別很大，手術(shù)前后的合理化療，有助于提高療效。目前發(fā)現(xiàn)許多天然藥物具有抗腫瘤作用.其中很多抗腫瘤藥物可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，而對正常細(xì)胞的毒副作用較小.如順鉑、阿霉素、喜樹堿、順鉑、阿糖胞苷、放線菌酮、環(huán)磷酰胺.這些藥物均可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,并且目前有不錯的效果。關(guān)鍵詞：順鉑阿霉素ＨｅＬａ細(xì)胞細(xì)胞增殖細(xì)胞凋亡1實(shí)驗(yàn)原理1．1HeLａ細(xì)胞HeＬa細(xì)胞是源自一名美國婦女的子宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞。HｅLa細(xì)胞株是由正常子宮頸細(xì)胞被一種人類乳突狀瘤病毒（HumanＰapｉlｌomaviruｓ18或HPＶ1８）轉(zhuǎn)型成癌細(xì)胞的HeLa細(xì)胞至今已被視為“不死的”，也就是說此細(xì)胞株（不同于其他人類細(xì)胞)不會老死，而且可以不限次數(shù)的分裂下去，而且已培養(yǎng)出一個不間斷的系列.從１9５1年至今，ＨeＬa細(xì)胞已經(jīng)培養(yǎng)了５0多年，分裂了1８０0０次以上仍然沒有停止的跡象。此細(xì)胞株即使和其他癌細(xì)胞相比，增殖依然異常迅速.１．2順鉑和阿霉素順鉑（順氯氨鉑，cisｐlatｉn,DDP)將所含之氯解離,然后與ＤＮA上的核堿鳥嘌呤、腺嘌呤和胞嘧啶形成ＤNA單鏈內(nèi)兩點(diǎn)的交叉聯(lián)結(jié)，也可能形成雙鏈間的交叉聯(lián)結(jié)，從而破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能.對RＮA和蛋白質(zhì)合品屬細(xì)胞周期非特異性藥物，具有細(xì)胞毒性,可抑制癌細(xì)胞的DNA復(fù)制過程，并損傷其細(xì)胞膜上結(jié)構(gòu),有較強(qiáng)的廣譜抗癌作用。臨床用于卵巢癌、癌前列腺癌、睪丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、惡性淋巴瘤、頭頸部鱗癌、甲狀腺癌及成骨肉瘤等多種實(shí)體腫瘤均能顯示療效.成的抑制作用較弱.屬周期非特異性藥物。阿霉素是一種抗腫瘤抗生素，通過抑制癌細(xì)胞遺傳物質(zhì)核酸的合成來殺滅癌細(xì)胞。鹽酸阿霉素對機(jī)體產(chǎn)生廣泛的生物化學(xué)效應(yīng)。具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性作用.其作用機(jī)制主要是阿霉分子嵌入ＤNA而抑制核酸的合成.1.3PI和Ho．３334２ＰI(碘化丙啶）：雙鏈核酸標(biāo)記物,親水性，不能通過完整細(xì)胞膜,激發(fā)光譜和發(fā)射光譜分別為535nm和61７ｎm,激發(fā)光波長范圍較寬，從紫光到綠光均可作為激發(fā)光。Hｏ．3３342:特異結(jié)合ＡＴ區(qū)的DNA標(biāo)記物，親脂性，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜分別為350ｎｍ和461ｎm細(xì)胞類型膜完整性染色質(zhì)凝集程度凋亡小體的形成ＰI染色Ｈｏ。333４2正常細(xì)胞完整不凝集無無法透過藍(lán)色凋亡細(xì)胞完整高度凝集有無法透過藍(lán)色壞死細(xì)胞破損一定程度的凝集無橘紅色藍(lán)色(同時染PI被橘紅色遮掩）1．４MTT比色法MTT比色法，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MＴT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Foｒmazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能.二甲基亞砜(ＤMＳＯ）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490ｎm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。1．5ＩC50IC50是指細(xì)胞被抑制一半時抑制劑的濃度，這里的反應(yīng)可以是酶催化反應(yīng)，抗原抗體反應(yīng)等。在凋亡方面,可以理解為一定濃度的某種藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡5０％，該濃度稱為50％抑制濃度,即凋亡細(xì)胞與全部細(xì)胞數(shù)之比等于５0％時所對應(yīng)的濃度,IC50值可以用來衡量藥物誘導(dǎo)凋亡的能力，即誘導(dǎo)能力越強(qiáng)，該數(shù)值越低,當(dāng)然也可以反向說明某種細(xì)胞對藥物的耐受程度。２．實(shí)驗(yàn)步驟2.1利用ＭＴＴ法檢測細(xì)胞增殖1、取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰酶消化計(jì)數(shù),配制細(xì)胞懸液濃度為４x１04/mL，取細(xì)胞接種到96孔板,每孔200μL，80０0細(xì)胞／孔。2、加藥處理：（1）２4小時后，待細(xì)胞貼壁后吸取培養(yǎng)基2００μL，棄除,調(diào)零孔不作處理。（2）設(shè)置藥物濃度分別為1x１0－3μg/μL、2ｘ10-３μg／μＬ、4x10－3μg/μL、6ｘ10-3μg／μL、8ｘ10-3μｇ/μL，對應(yīng)按每列分別加入Cｃ1、C2、Ｃ4、C6、Ｃ8（順鉑組），Cd１、D2、D4、Ｄ6、D8（阿霉素組）列中。96孔板上藥物分布如表１所示：（３)配置濃度梯度及加藥方法：藥物母液濃度為5mｇ/mL,即5μg/μL，順鉑溶于DMSO，鹽酸阿霉素溶于水。分別取0．4ｍL順鉑/阿霉素,加入1.６mLＤMSO／水,混合均勻,得到1μg/μL的順鉑及阿霉素溶液.順鉑與阿霉素的濃度梯度配置方法相同。取藥物2/4／8/12/1６μL，對應(yīng)加入1４/１2/8／4／0μＬＤMSO/水（藥物為順鉑即加DＭSO，藥物為阿霉素即加水）,各加入２mL培養(yǎng)基,即配制出濃度分別為為1x10^－3μg／μL、2x1０^－3μg／μL、４x10^—3μg／μL、6ｘ１0＾－3μg/μL、8x10^-3μg/μL的藥物。兩種藥物不同濃度分別相應(yīng)加入Cc1、Ｃ２、C4、C6、C8（順鉑組)，Cd１、D2、Ｄ４、D6、D8（阿霉素組)列中,每孔200μL。取培養(yǎng)基2mL，分別加入16μLＤＭSＯ／水，混合均勻,加入到對照１/對照２列中，每孔200μL。3、測定:取測定孔，棄去培養(yǎng)基,加１0０μL新鮮的培養(yǎng)基，加１２μLMＴT,4小時后加１00μL裂解液。過夜后,用酶標(biāo)儀測定OD值。4、根據(jù)測得ＯD值，用SＰＳＳ軟件進(jìn)行分析,求出以對照組吸光度OD值減少一半所需的藥物濃度IC50，即半數(shù)抑制濃度。2.2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察1、取生長到８0—9０％融匯度,對數(shù)生長期的細(xì)胞,按1:4比例傳代.取1瓶細(xì)胞傳到4瓶。2、按求得的順鉑及阿霉素濃度在傳代的第二天，向培養(yǎng)基中加入藥物或?qū)φ杖芤?。棄除?xì)胞培養(yǎng)瓶中原培養(yǎng)液，加入5mL新培養(yǎng)基。分別取濃度為5ｍg／mL的順鉑及阿霉素母液，其中順鉑7μＬ，阿霉素4μL各加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。對照組分別取DMSＯ７μL,水μL各加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。3、48—７2小時后，收集培養(yǎng)液,用胰酶適度消化細(xì)胞，用收集的培液吹打細(xì)胞,將分散成單個的細(xì)胞懸液收集至10mＬ離心管中，１０00ｒpｍ,離心15mｉn去上清,用0．2毫升PBS重懸細(xì)胞4、取2０0μlPBS細(xì)胞懸液，加入PＩ20μＬ（終濃度100μg/ml)，Ho。３33422μL（終濃度10μg/ml)，混勻,37度溫箱中避光標(biāo)記１5ｍin。（帶手套操作)5、1000ｒpm,離心10min，棄上清,加10-50μLPＢS重懸，取１0μL滴于載玻片上,蓋片（不能有氣泡或漂起)，保存于暗處.6、熒光顯微鏡觀察拍照（紫外激發(fā))。３.實(shí)驗(yàn)結(jié)果３。１ＭTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果順鉑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:分析：由MTＴ實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，可能會出現(xiàn)波動較大的數(shù)據(jù)，計(jì)算IC50時應(yīng)將這些數(shù)據(jù)舍去。根據(jù)所測OD值可算出順鉑對BGC—823細(xì)胞的IC50值為5。６９8左右。但數(shù)值波動較大,實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，綜合全班實(shí)驗(yàn)可知順鉑的添加濃度約為7。阿霉素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析:由MＴT實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，可能會出現(xiàn)波動較大的數(shù)據(jù)，計(jì)算IC50時應(yīng)將這些數(shù)據(jù)舍去。根據(jù)所測OＤ值可算出順鉑對BGC-823細(xì)胞的ＩC50值為３．054左右。但數(shù)值波動較大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定,綜合全班實(shí)驗(yàn)可知順鉑的添加濃度約為4。3。2順鉑和阿霉素對人宮頸癌細(xì)胞ＨeLa細(xì)胞凋亡的影響的形態(tài)學(xué)觀察圖一為Hｏ.3３34２2和PI染料雙染HｅLa細(xì)胞得到的細(xì)胞核形態(tài)圖。從圖中觀察可以看到有呈藍(lán)色的細(xì)胞，也有呈紅色的細(xì)胞。圖一中的A、B代表未加順鉑和阿霉素的空白對照。Ｃ為加入順鉑的HeＬａ細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)圖，D為加入阿霉素的HｅLa細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)圖。ＡBCD圖一Ho。3334２2-PI雙染觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)從圖一中可以看出，對照組A、Ｂ的細(xì)胞數(shù)目要明顯多于實(shí)驗(yàn)組Ｃ、Ｄ的細(xì)胞數(shù)目。C、D實(shí)驗(yàn)組加入了順鉑和阿霉素,由此說明順鉑和阿霉素確實(shí)對于細(xì)胞的生長具有抑制作用。當(dāng)比較A、C兩組的時候發(fā)現(xiàn),對照組基本上沒有出現(xiàn)凋亡細(xì)胞；分別觀察兩個視野可以發(fā)現(xiàn)，加藥組出現(xiàn)了部分凋亡細(xì)胞。從細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察結(jié)果可看到，視野中的壞死細(xì)胞較多,可能因?yàn)閷?shí)驗(yàn)操作不夠輕柔，從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死；也可能是在用胰酶消化細(xì)胞消化過度而引起的細(xì)胞壞死。因此實(shí)驗(yàn)時要注意以上兩點(diǎn)。當(dāng)BＤ兩組相比較可發(fā)現(xiàn)對照組基本上沒有出現(xiàn)凋亡細(xì)胞;分別觀察兩個視野可以發(fā)現(xiàn),加藥組出現(xiàn)了部分凋亡細(xì)胞(一個視野中有４個,另一個視野中有2個）。從細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察結(jié)果可看到,視野中有少量壞死細(xì)胞，可能因?yàn)閷?shí)驗(yàn)操作不夠輕柔,從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死；也可能是在用胰酶消化細(xì)胞消化過度而引起的細(xì)胞壞死。因此實(shí)驗(yàn)時要注意以上兩點(diǎn)。有上述的比較還可以知道,順鉑和阿霉素可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。4．實(shí)驗(yàn)總結(jié)綜合上面所述的三個結(jié)果分析，順鉑和阿霉素都對HｅLa細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用。5．