太子參醇提物對大鼠組織和紅細胞的抗氧化活性

太子參醇提物對大鼠組織和紅細胞的抗氧化活性作者： 張振明，葛斌，許愛霞，袁逸銘，高湘【關(guān)鍵詞】 太子參醇提物AntioxidativeactivityofEPHPHontissuesanderythrocytesofrats【Abstract】AIM:TostudytheantioxidativeactivityofthealcoholicextractfromPseudostellariaheterophyllaPaxetHoffm(EPHPH)anditsmechanism.METHODS:Theperoxidationinhomogenatesofheartandliverandkidneyofratswasinducedby?HOgenerationsystemFe2++ascorbicacid.Malondialdehyde（MDA）wasdeterminedusingTBAcolorimetricmethodandsuperoxide（O2-）fromzymosanstimulatedneutrophilsofratswasmeasuredbyNBTreductionmethod.H2O2causedhemolysisoferythrocyteswasmeasuredspectrometrically.RESULTS:MDAformationinhomogenatesofheartandliverandkidneyofratsinducedby?HOgenerationsystemFe2++ascorbicacidwasinhibiteddifferentlyby,,,,andμg/LEPHPH,whoseIC50thatinhibitedMDAformationinheart,liverandkidneywas,andμg/Lrespectively,whoserelationbetweenquantityandefficiencyshowedallnegativeandwhoserelativecoefficientwas-,-and-respectively(allP<).O2-generationfromzymosanstimulatedneutrophilsofratswasinhibiteddistinctlybyEPHPH,whoseIC50thatinhibitedO2-generationwasμg/L,whoserelationbetweenquantityandefficiencyshowednegativeandwhoserelativecoefficientwas-(P<).H2O2causedhemolysisoferythrocyteswasinhibiteddistinctlybyEPHPHwhoseIC50thatinhibitedhemolysisoferythrocyteswasμg/L,whoserelationbetweenquantityandefficiencyshowednegativeandwhoserelativecoefficientwas-(P<).CONCLUSION:EPHPHexertsitseffectonantioxidationbyscavenging?HO,O2-andH2O2inthebiologicalsystem.【Keywords】EPHPH;freeradicals;hemolysisextent;erythrocytes;activitiyofantioxidation【摘要】目的：研究太子參醇提物的抗氧化活性及其機制.方法：用?HO生成系統(tǒng)Fe2++抗壞血酸誘導(dǎo)大鼠心、肝、腎組織勻漿脂質(zhì)過氧化，TBA比色法測定MDA含量；NBT還原法測酵母多糖A刺激大鼠中性粒細胞產(chǎn)生的O2-；分光光度法測H2O2誘發(fā)的大鼠紅細胞溶血度.結(jié)果：，，，，和μg/L太子參醇提物不同程度抑制Fe2＋＋抗壞血酸誘導(dǎo)的大鼠心、肝、腎MDA生成，其抑制心、肝、腎MDA生成的IC50分別為,及μg/L,其量效關(guān)系均呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-,-,-（P均<）；不同程度抑制酵母多糖A刺激大鼠中性粒細胞生成O2-及紅細胞氧化溶血，IC50分別為和μg/L，其量效關(guān)系均呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-和-（P均<）.結(jié)論：太子參醇提物通過清除?HO,O2-及H2O2而發(fā)揮抗氧化活性.【關(guān)鍵詞】 太子參醇提物；自由基；溶血度；紅細胞；抗氧化活性0引言太子參（PseudostellariaheterophyllaPaxetHoffm,PHPH

）為傳統(tǒng)中藥，有補肺健脾功效

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近年有研究表明太子參總提物對環(huán)磷酰胺所致小鼠

T、B淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能低下及白細胞吞噬功能降低有顯著對抗作用， 并能增加外周血白細胞數(shù)，其水提物有抗氧化作用［1］. 我們通過實驗將太子參醇提物（EPHPH）對大鼠組織和紅細胞的抗氧化活性及其機制進行了探討 .材料和方法材料EPHPH用50mL/LDMSO溶解，硫代巴比妥酸（TBA）為上海試劑二廠產(chǎn)品，氯化硝基四氮唑藍（NBT）為上海前進試劑廠產(chǎn)品，酵母多糖A為Sigma產(chǎn)品，其它試劑均為進口或國產(chǎn)分析純.Wistar大鼠40只，雌雄不拘，體質(zhì)量（210±20）g，由蘭州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供.藥材購自本院藥房.方法的制備用回流提取法，將藥材適度粉碎，800mL/L乙醇浸泡24h，裝入瓶內(nèi)，約為容量的1/2，溶劑浸過藥材表面約2cm,水浴中加熱回流，放冷過濾，第1次回流1h，第2及第3次各約30min，回收乙醇，60℃干燥即得.樣品主要成分為太子參皂甙（批號： 20XX0816）.實驗分組及樣本量設(shè)空白組，對照組及6個劑量受試藥組(n=5). 空白組大鼠組織不加誘發(fā)劑，對照組加誘發(fā)劑，受試藥

1,2,3,4,5

和6組大鼠組織分別加誘發(fā)劑及,,,, 和μg/LEPHPH.酵母多糖A懸浮液的制備［2］酵母多糖A用大鼠血清懸浮為 50g/L,37℃溫育30min,4℃,3000g×10min離心，棄上清，用4倍量mmol/L磷酸緩沖鹽水（BPS,）沖洗，同法離心后棄上清，洗3次后用BPS懸浮，低溫貯存?zhèn)溆?中性粒細胞的制備［2］大鼠腹腔注射液體石臘10mL,20~22h斷頭處死，4℃Hanks(mmol/L)（Ca2＋,Mg2＋,Glucose，pH）分3次抽洗出腹腔滲出液，4℃,500g×10min離心，棄上清，4倍量Hanks液洗滌及同法離心，洗3次后用Hanks液懸浮，調(diào)中性粒細胞計數(shù)為1×106/L，低溫貯存?zhèn)溆?紅細胞的制備［2］大鼠斷頭取肝素抗凝全血，20XXg×6min離心，棄血漿，所剩紅細胞用4倍量生理鹽水洗滌及同法離心，洗3次后用生理鹽水懸浮，調(diào)紅細胞體積分數(shù)為%,貯存?zhèn)溆?OH生成系統(tǒng)誘發(fā)大鼠心、肝、腎勻漿產(chǎn)生丙二醛（MDA）的測定［3］大鼠心、肝、腎用Tris 緩沖液（mmol/LTrisHCl,mmol/LEDTA2Na,mmol/L 蔗糖,g/LNaCl，pH）制備成5%勻漿，取組織勻漿1mL及藥液（對照及空白管加μmol/LDMSO）置反應(yīng)管，37℃溫育10min,除空白管外各管加入50∶50mol/LFe2++抗壞血酸溶液（終濃度），繼續(xù)溫育30min,用TBA比色法測定MDA含量.酵母多糖A刺激大鼠中性粒細胞生成O2-的測定［2］取中性粒細胞懸浮液1mL，按NBT還原法測定O2-，用吡啶作參比，515nm處測A，以NBT還原物甲替的量反映O2-的變化.抑制率（=對照管A-測試管A）（/對照管A-空管A）×100%.誘發(fā)大鼠紅細胞氧化溶血的測定［2］取紅細胞懸浮液1mL,加入100mmol/LH2O2（空白管不加H2O2）及藥液,37℃溫育1h,加4倍量生理鹽水稀釋，3000g×6min離心,上清液于415nm處測A.用線性回歸求算IC50，溶血度=（測試管A-空白管A）/（對照管A-空白管A）×100%.統(tǒng)計學(xué)處理：數(shù)據(jù)用x±s表示，統(tǒng)計軟件SPSS進行分析，組間實驗數(shù)據(jù)顯著性差異用單因素方差分析及多組間均數(shù)兩兩比較，受試藥量效相關(guān)顯著性差異用相關(guān)性檢驗分析，P<表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義.結(jié)果對?OH生成系統(tǒng)誘發(fā)大鼠心、肝、腎勻漿 MDA的影響大鼠心、肝、腎勻漿經(jīng)Fe2＋＋抗壞血酸溶液誘發(fā)后MDA顯著升高，而EPHPH可顯著抑制MDA含量升高，其量效關(guān)系均呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-,-,-,相關(guān)性檢驗P值均<抑制心、肝、腎MDA生成的IC50分別為,及μg/L（Tab1）.表1EPHPH對?OH生成系統(tǒng)誘發(fā)大鼠心、肝、腎勻漿MDA的影響（略）對大鼠中性粒細胞生成O2-及紅細胞氧化溶血的影響大鼠中性粒細胞受酵母多糖A刺激后O2-顯著升高，紅細胞經(jīng)H2O2誘發(fā)后溶血度顯著升高，,,,,和μg/LEPHPH不同程度抑制酵母多糖A刺激大鼠中性粒細胞生成O2-及紅細胞氧化溶血，其IC50分別為和μg/L（Tab2）.表2EPHPH對大鼠中性白細胞生成O2-及紅細胞氧化溶血的影響（略）討論Fe2＋＋抗壞血酸產(chǎn)生?OH是基于Fenton反應(yīng)原理進行的,抗壞血酸+2H++2O2→-H2O2+脫氫抗壞血酸，F(xiàn)e2++H2O2→Fe3++OH-+?OH.可見少量抗壞血酸可清除O2-，對機體有保護作用.H2O2和O2-均為正常組織中氧的代謝產(chǎn)物，大量抗壞血酸存在時組織中H2O2形成反而增多，它與Fe2+反應(yīng)生成毒性更大的OH，引起脂質(zhì)過氧化.氧自由基包括羥自由基（?OH）和超氧陰離子自由基（O2-）不斷產(chǎn)生于生物體.適量自由基對細胞的分裂，生長，消炎，解毒等起積極作用，但過剩會損傷細胞膜，使DNA斷裂，蛋白質(zhì)變性，酶失活，最后導(dǎo)致細胞解體和死亡.脂質(zhì)過氧化是氧自由基損傷組織的重要方式，其損傷途徑為：氧自由基+細胞膜脂質(zhì)→脂質(zhì)過氧化反應(yīng)→過氧化脂質(zhì)→MDA.可見脂質(zhì)過氧化與氧自由基密切相關(guān).若設(shè)法清除氧自由基，就可抑制脂質(zhì)過氧化.業(yè)已證明，氧自由基過?？烧T發(fā)炎癥、免疫失調(diào)、惡性腫瘤等，也是導(dǎo)致肝，腎缺血性損傷及心腦組織缺血再灌注損傷的關(guān)鍵因素，研究和開發(fā)抗氧化劑及自由基清除劑對防治與自由基有關(guān)的疾病有重大意義.本實驗結(jié)果表明：,,,,和μg/LEPHPH能不同程度抑制Fe2＋＋抗壞血酸誘導(dǎo)的大鼠心、肝、腎脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA生成，這提示EPHPH具有清除?OH的顯著作用；能不同程度抑制酵母多糖A刺激中性粒細胞生成O2-，其量效關(guān)系呈負相關(guān)；能不同程度抑制H2O2誘發(fā)的紅細胞氧化溶血，其量效關(guān)系呈負相關(guān).提示EPHPH具有清除H2O2及對抗生物膜過氧化的顯著作用；可見，EPHPH通過清除?OH,O2-及H2O2而發(fā)揮抗氧化活性.本實驗結(jié)果顯示EPHPH是一種有效的氧自由基清除劑，可能用于與自由基相關(guān)疾病的防治.【參考文獻】［1］NgTB,LiuF,WangHX.Theantioxidanteffectsofaqueousandorganicextractsofpanaxquinquefolium,panaxnotoginseng,codonopsispilosula,pseudostellariaheterophyllaandglehnialittoralis［J］.JEthnopharmacol,20XX;93(23):285-288.［2］葛斌，陳立德，張振明.4磺酸酯基對大鼠組織和紅細胞的抗脂質(zhì)過氧化作用［

2,2,6,6 四甲基哌啶氮氧自由J］. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志 ,20XX