分子遺傳學基因突變與重組遺傳學詳解演示文稿

分子遺傳學基因突變與重組遺傳學詳解演示文稿1現(xiàn)在是1頁\一共有149頁\編輯于星期五優(yōu)選分子遺傳學基因突變與重組遺傳學2現(xiàn)在是2頁\一共有149頁\編輯于星期五3現(xiàn)在是3頁\一共有149頁\編輯于星期五4現(xiàn)在是4頁\一共有149頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)因子特異DNA序列編碼序列啟動序列操縱序列其他調(diào)節(jié)序列(promoter)(operator)5現(xiàn)在是5頁\一共有149頁\編輯于星期五6現(xiàn)在是6頁\一共有149頁\編輯于星期五7現(xiàn)在是7頁\一共有149頁\編輯于星期五8現(xiàn)在是8頁\一共有149頁\編輯于星期五9現(xiàn)在是9頁\一共有149頁\編輯于星期五10現(xiàn)在是10頁\一共有149頁\編輯于星期五11現(xiàn)在是11頁\一共有149頁\編輯于星期五AGAATTTTCTAACTAAAAGTTCATAAGACAAACCCAAACATTGTCATGTTTCTCGGTTCTTTCTTACAACCCAAGCTGACCCTTAACATCATCGAAGAGTCCCCCCCACCGAAAGCCCTCCCCTCTGCTCTTAAAGTCCCCTTCATTCCATTACAAAAATGTCCGAACTCTGATATCCCTTCACTTATCTTTCCACCACCACAATTCCACCAGTTCCAAGCTTCTTTTCAAACAACAAAACCCCACATGTCTTCCTTTTCGGTCCGTTTCTTTGCTCCACAACAGCCGTTACTGCCGTCCACAGCTTCCTCTTTCAAGCCCAAAACATGGGTTATGGCAGCTCCCACGACGGCGCCAGCGACTTCGGTGGATGTCGACGGGCAGAGGTTGGAACCCCGAGTTGAAGAACGAGAGGGGTACTTCGTGTTGAAAGAGAAGTTCAGAGATGGCATCAACCCTCAAGAGAAAATAAAGATCGAGAAAGACCCTTTGAAGCTTTTCATGGAAGCTGGGATTGATGAACTCGCTAAGATGTCGTTCGAGGATATTGATAAAGCTAAGGCTACAAAGGACGACATTGATGTTAGACTTAAATGGCTCGGCTTGTTCCATAGGAGAAAACATCAATATGGGAGATTTATGATGAGATTAAAACTACCAAATGGTGTAACAACAAGTGCACAAACACGGTACTTAGCCAGTGTGATAAGGAAATACGGCAAAGAAGGGTGTGCAGATGTTACGACAAGGCAAAACTGGCAAATCCGTGGAGTGGTGTTGCCTGATGTGCCTGAAATACTTAAGGGTCTCGACGAAGTAGGCTTGACGAGCCTACAGAGTGGCATGGACAATGTGAGGAACCCTGTTGGTAATCCTCTTGCCGGCATCGACCCCGAAGAGATTGTCGATACTCGACCTTATACCAACTTGTTATCTCAGTTCATCACCGCCAATTCCCGCGGCAATCCGGCTTTTGCCAACTTGCCTAGGAAATGGAATGTCTGTGTCGTGGGGTCTCATGATCTTTACGAACATCCCCATATCAATGATCTCGCTTATATGCCGGCGACGAAAAACGGACGATTTGGGTTTAATTTGCTGGTTGGTGGGTTCTTTAGTGCCAAGAGATGTGATGAGGCCATTCCTCTTGATGCTTGGGTCTCAGCTGATGATGTGATTCCATTGTGCAAAGCTGTGTTAGAAGCCTATAGGGATCTTGGATACAGGGGCAATAGGCAAAAGACTAGAATGATGTGGCTGATTGATGAACTGGGTATTGAAGTGTTCAGATCAGAAGTAGCCAAAAGAATGCCTCAGAAAGAGTTGGAGAGAGCATCTGATGAAGATTTGGTTCAAAAGCAATGGGAAAGGAGAGACTACCTTGGTGTCCATCCGCAAAAGCAAGAAGGTTTCAGCTACATCGGCATTCACATCCCAGTCGGTCGAGTCCAAGCCGACGACATGGACGAACTAGCCCGGTTAGCCGACACGTATGGCTCGGGCGAATTCAGACTCACTGTGGAGCAAAACATCATAATCCCCAACGTTGAGAACTCGAAACTAGAAGCATTACTAAACGAGCCTCTATTGAAAGACCGGTTTTCACCCCAACCAAGTATTCTCATGAAAGGGCTAGTAGCTTGTACTGGTAACCAGTTTTGCGGACAAGCCATTATTGAAACAAAAGCTAGAGCCTTGAAGGTGACGGAAGAGGTTGAAAGGCTAGTGTCGGTGAGCCGGCCGGTGAGGATGCATTGGACCGGTTGCCCCAACACGTGTGGTCAAGTCCAAGTGGCGGATATAGGTTTCATGGGGTGCATGGCAAGGGATGAGAATGGGAAACCATGTGAAGGGGCAGACATATTTTTGGGAGGGAGAATTGGGAGTGACTCCCATTTAGGAGAGCTTTATAAGAAGGGTGTCCCTTGTAAGAACTTGGTACCTGTAGTTGCTGACATTTTGGTGGAACCCTTTGGAGCTGTCCCTAGGCAAAGGGAAGAAGGGGAAGATTGATTCAAAATCAACTTCATTTCATTCCATTACTTTTATATTTGTTTTATTTTTTTTTTTTAATAACCAAGAAAAA12現(xiàn)在是12頁\一共有149頁\編輯于星期五MSSFSVRFFAPQQPLLPSTASSFKPKTWVMAAPTTAPATSVDVDGQRLEPRVEEREGYFVLKEKFRDGINPQEKIKIEKDPLKLFMEAGIDELAKMSFEDIDKAKATKDDIDVRLKWLGLFHRRKHQYGRFMMRLKLPNGVTTSAQTRYLASVIRKYGKEGCADVTTRQNWQIRGVVLPDVPEILKGLDEVGLTSLQSGMDNVRNPVGNPLAGIDPEEIVDTRPYTNLLSQFITANSRGNPAFANLPRKWNVCVVGSHDLYEHPHINDLAYMPATKNGRFGFNLLVGGFFSAKRCDEAIPLDAWVSADDVIPLCKAVLEAYRDLGYRGNRQKTRMMWLIDELGIEVFRSEVAKRMPQKELERASDEDLVQKQWERRDYLGVHPQKQEGFSYIGIHIPVGRVQADDMDELARLADTYGSGEFRLTVEQNIIIPNVENSKLEALLNEPLLKDRFSPQPSILMKGLVACTGNQFCGQAIIETKARALKVTEEVERLVSVSRPVRMHWTGCPNTCGQVQVADIGFMGCMARDENGKPCEGADIFLGGRIGSDSHLGELYKKGVPCKNLVPVVADILVEPFGAVPRQREEGED編碼588氨基酸的蛋白質(zhì)序列13現(xiàn)在是13頁\一共有149頁\編輯于星期五14現(xiàn)在是14頁\一共有149頁\編輯于星期五7.2點突變的類型

7.3突變發(fā)生的機理(自發(fā)突變，誘發(fā)突變)7.4保證生物體遺傳穩(wěn)定性的機制7.5基因重組交換的分子機制7.1有關(guān)突變的基本概念主要內(nèi)容15現(xiàn)在是15頁\一共有149頁\編輯于星期五7.1有關(guān)突變的基本概念突變(mutation)：可以通過復制而遺傳的DNA結(jié)構(gòu)的任何永久性改變。突變是一種遺傳狀態(tài)，是相對于正常狀態(tài)而言突變體(mutant)：攜帶突變基因的生物個體或群體遺傳突變：包括核苷酸點突變和染色體突變（染色體數(shù)目和染色體結(jié)構(gòu)的改變)點突變：在一個基因內(nèi)部發(fā)生的一個或數(shù)個核苷酸對的增加、缺失或取代，稱為點突變16現(xiàn)在是16頁\一共有149頁\編輯于星期五表示方法表現(xiàn)型Arg+Arg-基因型arg+

arg-

野生型正性狀突變基因(mutantgene):存在突變位點的基因野生型基因（wildtypegene）：沒有發(fā)生突變的基因突變率:單位時間內(nèi)（如細胞世代內(nèi)）某一基因突變發(fā)生的頻率。17現(xiàn)在是17頁\一共有149頁\編輯于星期五突變的多方向性和復等位基因

基因突變的方向是不定的，可以多方向發(fā)生。A→a，A→a1，A→a2，A→a3，A→an?；駻可突變?yōu)閍也可以突變?yōu)閍1、a2、a3等，它們對A來說都是隱性基因

Aa1a2a3a4a5a618現(xiàn)在是18頁\一共有149頁\編輯于星期五遺傳試驗表明這些隱性突變基因彼此之間，以及它們與A基因之間都存在有對性關(guān)系19現(xiàn)在是19頁\一共有149頁\編輯于星期五具有對性關(guān)系的基因是位于同一基因位點上的。位于同一基因位點的各個等位基因，在遺傳上稱為復等位基因。復等位基因不存在于同一個體，而是存在于同一生物類型的不同個體里。20現(xiàn)在是20頁\一共有149頁\編輯于星期五21現(xiàn)在是21頁\一共有149頁\編輯于星期五復等位基因廣泛存在于生物界，煙草中有兩個野生種，N.forgation和N.alate表現(xiàn)自交不親和性。在這些煙草中發(fā)現(xiàn)15個自交不親和復等位基因S1、S2、S3、S4……S15等控制自花授粉的不結(jié)實。自交不親和性是指自花授粉不結(jié)實，而株間授粉卻能結(jié)實的現(xiàn)象。試驗表明，具有某一基因的花粉不能在具有同一基因的柱頭上萌發(fā)，好象同一基因之間存在一種抵抗作用。22現(xiàn)在是22頁\一共有149頁\編輯于星期五s1s2和s1s2雜交不能結(jié)實：23現(xiàn)在是23頁\一共有149頁\編輯于星期五基因突變的時期突變可以發(fā)生在生物個體發(fā)育的任何時期，性細胞發(fā)生的突變可以通過受精直接傳遞給后代顯性突變：aA當代表現(xiàn)隱性突變：Aa當代不表現(xiàn)24現(xiàn)在是24頁\一共有149頁\編輯于星期五體細胞如果發(fā)生突變，突變的體細胞在生長過程中，往往競爭不過周圍的正常細胞，受到抑制或最終消失保留體細胞的突變，需將它從母體上及時分割下來加以無性繁殖，許多植物的突變就是體細胞的突變結(jié)果。如果果樹上一旦發(fā)生優(yōu)良突變，即可直接采用無性繁殖方法育成新品種25現(xiàn)在是25頁\一共有149頁\編輯于星期五26現(xiàn)在是26頁\一共有149頁\編輯于星期五27現(xiàn)在是27頁\一共有149頁\編輯于星期五28現(xiàn)在是28頁\一共有149頁\編輯于星期五29現(xiàn)在是29頁\一共有149頁\編輯于星期五（1）取代(conversion)轉(zhuǎn)換(transition)

PyPy

Pu

Pu

顛換(transversion)

Py

Pu

7.2.1點突變的種類

7.2點突變的類型１．轉(zhuǎn)換（transition）：指ＤＮＡ分子中的嘌呤為另一種嘌呤或嘧啶為另一種嘧啶所取代而引起的突變。２．顛換（transversion）:指DNA分子中的嘌呤被嘧啶取代或嘧啶被嘌呤取代所引起的突變。30現(xiàn)在是30頁\一共有149頁\編輯于星期五轉(zhuǎn)換31現(xiàn)在是31頁\一共有149頁\編輯于星期五顛換32現(xiàn)在是32頁\一共有149頁\編輯于星期五轉(zhuǎn)換和顛換的相互關(guān)系示意圖33現(xiàn)在是33頁\一共有149頁\編輯于星期五（2）核苷酸缺失突變或插入突變

=3xdNt

±nxAminoacid對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響較小

=3xdNt

Frameshift(移框突變)改變了氨基酸的組成，也會出現(xiàn)蛋白質(zhì)合成過早終止移碼突變（frameshiftmutation）：指ＤＮＡ分子中插入或缺失一個或少數(shù)幾個核苷酸，使整個閱讀框改變而引起的突變。34現(xiàn)在是34頁\一共有149頁\編輯于星期五Examplesofdeletionmutations

35現(xiàn)在是35頁\一共有149頁\編輯于星期五7.2.2堿基取代的效應(yīng)從對遺傳信息的改變上同義突變(synonymousmut.)：指沒有改變產(chǎn)物氨基酸序列的密碼子的變化，與密碼子的簡并性有關(guān)。GAA(Glu)→GAG(Glu)

錯義突變(Missensemut.)：指堿基序列的改變引起了產(chǎn)物氨基酸序列的改變。GAA(Glu)→AAA(Lys)

無義突變(Nonsensemut.)：指某個堿基的改變使代表某種氨基酸的密碼子變?yōu)榈鞍踪|(zhì)合成的終止密碼子。產(chǎn)物一般沒有活性。

AAG(Lys)→UAG(stop)

無義突變類型UAA（Oc）赭石型（Ocher）UAG（Am）琥珀型（amber）UGA（Opal）乳石型（Opal）36現(xiàn)在是36頁\一共有149頁\編輯于星期五(４)延長突變（elongationmutation）：這是一類剛好與無義突變相反的突變，是由于終止密碼子突變?yōu)榫幋a子，使肽鏈延長。

37現(xiàn)在是37頁\一共有149頁\編輯于星期五38現(xiàn)在是38頁\一共有149頁\編輯于星期五獲得突變型是遺傳學研究的重要前提

非條件型突變；

alleleinDNAlevel(RFLP,RAPD…)

alleleinphenotyle(紅花/白花，糯/非糯…)

條件型突變；

突變的表現(xiàn)=突變基因型+誘導條件

（光，溫敏感不育，Ts,su--…）

7.2.3突變的表達類型

有些基因突變的結(jié)果在正常生長情況下表型沒有明顯的改變，但在特定條件下可以表現(xiàn)為不同程度的改變甚至死亡39現(xiàn)在是39頁\一共有149頁\編輯于星期五TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGCAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG40現(xiàn)在是40頁\一共有149頁\編輯于星期五ABCPCRABCSSR多態(tài)性分析示意圖ABC分別代表不同的基因型41現(xiàn)在是41頁\一共有149頁\編輯于星期五SSR引物的擴增42現(xiàn)在是42頁\一共有149頁\編輯于星期五7.3.1自發(fā)突變

（1）堿基異構(gòu)式替代正常堿基引起DNA復制過程錯誤

a)堿基異構(gòu)式

A(amino)A(imino)

C(a)C(i)

G(keto)G(enol)

G(k)

G(e,i)

T(keto)

T(enol-2’)orT(enol-4’)

在細胞內(nèi)某些因素的作用下即可發(fā)生。突變的頻率平均為每一核苷酸每一世代10－9～10－107.3突變發(fā)生的機理(自發(fā)突變，誘發(fā)突變)

43現(xiàn)在是43頁\一共有149頁\編輯于星期五嘧啶Pyrimidines嘌呤Purines堿基、核苷、核苷酸☉堿基NitrogenousbasesUracil(U)44現(xiàn)在是44頁\一共有149頁\編輯于星期五b)堿基異構(gòu)式引起DNA復制的錯配

G(k)C(a)

正確配對A(a)T(k)

錯誤配對G(k)T(e)

A(a)

C(i)

A(i,anti)A(a,syn)A(i,anti)G(k,syn)

G(e,i,anti)G(k,syn)G(e,i,anti)A(a,syn)

A(i)

C(a)

G(e)

T(k)

45現(xiàn)在是45頁\一共有149頁\編輯于星期五A(a)

T(k)

A(a,anti)

T(k,anti)

C(i)

C(a,anti)

A(a)

A(a,anti)

堿基異構(gòu)式引起DNA的錯配突變

C(i)

C(a)G(k,syn)

G(k,syn)

G(k,anti)G(k)46現(xiàn)在是46頁\一共有149頁\編輯于星期五（2）重復序列間的非對等（不對稱）交換

（3）增變基因（mutatorgene）

生物體內(nèi)有些基因與整個基因組的突變率直接相關(guān)。當這些基因突變時，整個基因組的突變率明顯上升，這些基因稱為增變基因增變基因類別DNApolymerase相關(guān)基因3’5’editingfunctionmutation錯配修復系統(tǒng)的基因MCE(mismatchcorrectionenzyme)DNA

損傷修復系統(tǒng)基因錯配，修復功能喪失突變率升高47現(xiàn)在是47頁\一共有149頁\編輯于星期五7.3.2誘發(fā)突變

（1）物理誘變

a)電離輻射誘變

Co60(χ)(γ)ray

Cs137(χ)(γ)ray

H3(α)ray

P32,,S35(β)ray

衛(wèi)星搭載誘變；

高真空，強輻射，微重力

(χ)(γ)ray穿透性

（外照射處理）

(α)(β)ray非穿透性

（內(nèi)標記處理）

dNt電荷及結(jié)構(gòu)改變

導致DNA的斷裂、錯接及堿基配對關(guān)系的改變48現(xiàn)在是48頁\一共有149頁\編輯于星期五航天誘變品種矮稈早熟大豆（右）與相對照的大豆品種

49現(xiàn)在是49頁\一共有149頁\編輯于星期五50現(xiàn)在是50頁\一共有149頁\編輯于星期五51現(xiàn)在是51頁\一共有149頁\編輯于星期五太空西瓜52現(xiàn)在是52頁\一共有149頁\編輯于星期五太空蘿卜53現(xiàn)在是53頁\一共有149頁\編輯于星期五54現(xiàn)在是54頁\一共有149頁\編輯于星期五55現(xiàn)在是55頁\一共有149頁\編輯于星期五電離輻射誘變的作用規(guī)律輻射劑量的表示方法：X射線、γ射線：倫琴(R)；中子：積分流量(n/cm2)；β射線：微居里(μcu/g)。突變率與輻射劑量：突變率與輻射總劑量成正比；突變率與劑量率(輻射強度的影響)無關(guān)。56現(xiàn)在是56頁\一共有149頁\編輯于星期五b)非電離輻射—UltraVioletlight(U.V)大劑量的UV照射；相鄰的兩個T或兩個C或C和T之間均可以形成嘧啶二聚體，最容易形成的是TT二聚體在人皮膚中，每小時由于UV而產(chǎn)生嘧啶二聚體的頻率為5×104／細胞UV因穿透力有限，對于人的作用僅限于皮膚，但可以影響微生物的存活57現(xiàn)在是57頁\一共有149頁\編輯于星期五pyrimidinedimer(TTdimer)isgeneratedbycovalentlinks

betweenadjacentTT

∧U.V.…CTTA…環(huán)丁基嘧啶二聚體58現(xiàn)在是58頁\一共有149頁\編輯于星期五主要是紫外線：紫外線的作用機制：激發(fā)作用：T-T，CU；穿透能力與處理方法：微生物或植物配子最有效波長260nm(嘌呤、嘧啶的共軛環(huán))間接誘變作用：培養(yǎng)基內(nèi)H2O2的產(chǎn)生；物理誘變的非專性：對DNA分子及其核苷酸殘基無選擇性，所以沒有?；院吞禺愋?。脫氨59現(xiàn)在是59頁\一共有149頁\編輯于星期五（2）生物技術(shù)定點誘變（3）化學誘變（4）轉(zhuǎn)座子和Ti質(zhì)粒介導的插入突變1.提高基因突變率；2.獲得更豐富的突變類型；3.改良生物的個別性狀。應(yīng)用60現(xiàn)在是60頁\一共有149頁\編輯于星期五(5-BrU,5-溴尿嘧啶)酮式烯醇式Kea)堿基類似物在DNA復制時的滲入造成堿基錯誤配對（3）化學誘變61現(xiàn)在是61頁\一共有149頁\編輯于星期五5-BrU(k)

5-BrU(e)ReplicationBrU(k)BrU(e)ATGCreplicationerrorA/T

G/CincorporationerrorG/CA/TAGReplication62現(xiàn)在是62頁\一共有149頁\編輯于星期五A(a)T(k)5-BrU(k)G(k)5-BrU(e)C(a)mispairingmispairingT(k)A(a)5-BrU(k)G(k)C(e)5-BrU(e)A(a)G(k)G(k)A(a)ReplicationerrorIncorporationerror5-BrU(k)5-BrU(e)63現(xiàn)在是63頁\一共有149頁\編輯于星期五5-BrU(k)

5-BrU(e)ReplicationBrU(k)BrU(e)GCreplicationerrorA/T

G/CincorporationerrorG/CA/TInDNABrU(k)>BrU(e)(normal)(isoform)BrU(k)

BrU(e)難易AGGATCCT>64現(xiàn)在是64頁\一共有149頁\編輯于星期五HNO2(NitrousacidNA)引起氧化脫氨反應(yīng),氨基變?yōu)橥鵥)DNA分子上堿基的化學修飾導致堿基錯誤配對ACGInosineCUracilAXanthineCdeamination

HNO2黃嘌呤次黃嘌呤65現(xiàn)在是65頁\一共有149頁\編輯于星期五ATHNO2ITICGC復制復制ATGC轉(zhuǎn)換66現(xiàn)在是66頁\一共有149頁\編輯于星期五

DNA分子上堿基的化學修飾導致堿基錯誤配對C(i)A(a)HNHHOC(a)HAHNHHHOHNHHOHNHHOHNHHONHNH2OH(HydroxylamineHA羥胺)對C具有專化性，并特異地誘發(fā)G?CA?T67現(xiàn)在是67頁\一共有149頁\編輯于星期五GCNH2OHGChACh復制復制GCAT轉(zhuǎn)換AT68現(xiàn)在是68頁\一共有149頁\編輯于星期五烷基化試劑的致突變作用EMS(甲磺酸乙酯Ethylmethanesulfanate)CH3—S—O--CH2CH3OOMMSCH3—S—O--CH3OOSM(SulfurMustardsgas硫芥子氣)HSCH2CH2ClCH2CH2Cl69現(xiàn)在是69頁\一共有149頁\編輯于星期五70現(xiàn)在是70頁\一共有149頁\編輯于星期五誘變效應(yīng):使堿基多處發(fā)生烷化，導致DNA結(jié)構(gòu)變異烷基化位點主要在G的N-7位和A的N-3位，A的N-7位也可以烷基化。烷基化的結(jié)果有兩種：一是使G不再與C配對，而與T配對，造成G?CA?T的轉(zhuǎn)換GCG(7)T烷基化復制AT71現(xiàn)在是71頁\一共有149頁\編輯于星期五GCG*C烷基化去嘌呤C第二輪復制GCAT和TACG和轉(zhuǎn)換顛換二是減弱N9位上的N-糖苷鍵，產(chǎn)生去嘌呤作用。大部分無嘌呤位點都可以被無嘌呤內(nèi)切酶系統(tǒng)修復，但有時復制在修復之前進行，則在無堿基的位置上可以插入任何一個堿基，在第二輪復制之后，G?C對可以變?yōu)槿魏螇A基對G?C，C?G，A?T，T?A，既有轉(zhuǎn)換又有顛換72現(xiàn)在是72頁\一共有149頁\編輯于星期五c)嵌合劑的致突變作用AO(吖啶橙AcridineOrange)扁平分子EB(溴化乙錠EthidiumBromide)嵌合劑的分子大小與DNA的堿基對大小差不多，可以嵌合到DNA的堿基對之間，原來相鄰的兩個堿基對分開一定的距離，含有嵌合劑的DNA在下一輪復制時，可以隨機插入一個堿基，偶爾也有兩個（插入突變）。有時發(fā)生很低頻率的單堿基缺失突變，這些突變都會引起閱讀框的改變。73現(xiàn)在是73頁\一共有149頁\編輯于星期五TACGAATCGGGTATTATGCTTAGCCCATAATACGAATCGGGTATTATGCTTAGCCCATAACG染料分子嵌入復制插入一個堿基對移碼突變74現(xiàn)在是74頁\一共有149頁\編輯于星期五插入分子引起移碼突變75現(xiàn)在是75頁\一共有149頁\編輯于星期五76現(xiàn)在是76頁\一共有149頁\編輯于星期五7.3.3突變熱點(hotspotofmutation)任何一種生物的各個基因自發(fā)突變的頻率是一定的不同基因DNA序列不同形成特定排列的突變熱點頻率不同玉米R粒色I色素抑制基因Pr紫色Su非甜Y黃色子粒Sh飽滿子粒492×10-6106×10-611×10-62.4×10-62.2×10-61.2×10-677現(xiàn)在是77頁\一共有149頁\編輯于星期五a)m5C5-甲基胞嘧啶的存在是突變熱點形成的最主要原因U（突變率很低）（可以被尿嘧啶糖基酶系統(tǒng)修復）C

deaminationm5CTdeaminationG若發(fā)生在模板鏈上，很快引起突變；若發(fā)生在DNA復制期間的新生鏈上，可被錯配修復系統(tǒng)修復；若發(fā)生在DNA非復制期，由于DNA兩條鏈的甲基化程度相同，錯配修復系統(tǒng)失去判別標準，只能隨機的切除一個，因此有一半的可能性發(fā)生突變。78現(xiàn)在是78頁\一共有149頁\編輯于星期五b)DNA中的repetitiveseq./palindromicseq.e.g.Lac.OperonCTGGCTGGCTGG復制時，模板鏈與新生鏈間滑動錯配CTGG序列的缺失突變或插入突變79現(xiàn)在是79頁\一共有149頁\編輯于星期五為了保證遺傳信息的高度穩(wěn)定性，生物體在進化過程中形成了一系列多步驟的修復機制：（1）糾正偶然的復制錯誤的系統(tǒng)，如DNA聚合酶的3’5’的校對功能；尿嘧啶糖基酶修復系統(tǒng)；錯配修復系統(tǒng)（2）能修復環(huán)境因素（如射線）和體內(nèi)化學物質(zhì)造成的DNA分子損傷的系統(tǒng)，如光復活修復系統(tǒng)、切除修復系統(tǒng)、重組修復系統(tǒng)、SOS修復系統(tǒng)等（3）對付外源DNA的入侵：限制－修飾系統(tǒng)（4）基因的回復突變（5）致死突變（6）密碼的簡并（7）多倍體……7.4生物體保證遺傳穩(wěn)定性的機制80現(xiàn)在是80頁\一共有149頁\編輯于星期五7.4.1復制過程中的錯配修復機制(ξ=10-11)主要作用于復制過程中和復制完成后的較短時間內(nèi)，所要修復的錯誤堿基已經(jīng)存在于新生DNA鏈的內(nèi)部，稱為復制修復（1）錯配修復系統(tǒng)(Mismatchrepairsystem)DNA聚合酶將極少數(shù)錯誤堿基遺留在DNA鏈上而未進行糾正的頻率為10－8即108個堿基中有一個堿基是不配對的錯誤堿基；實際測得的突變頻率為10－10或10－11由于DNA的完整性和精確性是生命的根本所在，因而在細胞中演化出另一個修復系統(tǒng)叫錯配修復系統(tǒng)，給予第二次糾正錯誤的機會81現(xiàn)在是81頁\一共有149頁\編輯于星期五腺嘌呤的的甲基化是錯配修復系統(tǒng)的識別標志，這一標志有三個特征：在DNA中，天然的甲基化堿基有兩種，N6-甲基腺嘌呤(m6A)和5－甲基胞嘧啶(m5C)，m5C與識別無關(guān)。（1）具有堿基序列特異性，m6A一般包含在GATC序列中（2）沿新生DNA鏈有一個甲基化的梯度，靠近復制叉處的甲基化程度最?。?）親本鏈上的甲基化程度高而且均一根據(jù)以上特征，此系統(tǒng)就可以識別模板鏈和新生鏈，從而糾正新生鏈上的錯配堿基錯配修復系統(tǒng)受甲基化的引導82現(xiàn)在是82頁\一共有149頁\編輯于星期五（1）錯配修復系統(tǒng)(Mismatchrepairsystem)DNApolymeraseligaseMCE(mismatchcorrectenzyme,錯配校正酶)由3subunits

mutH,L,S組成Scanning新生鏈中錯配堿基識別新生鏈中未m6A的GATC序列酶切含錯配堿基的新生DNA區(qū)段H亞基L亞基S亞基83現(xiàn)在是83頁\一共有149頁\編輯于星期五MCEscanningDNA中的GATC(palindromicseq.)為m6A甲基化敏感位點平均每2kb左右有一GATCseq.3’

-CCTAGCTAG

5’5’TGATCGATC

3’3’5’少梯度多（m6A）新生鏈84現(xiàn)在是84頁\一共有149頁\編輯于星期五MCEscanningendonucleasePolymeraseligaseGATC

GATCCTAGCTAGTCGATC

GATCCTAGCTAGTGATC

GATCCTAGCTAGTA85現(xiàn)在是85頁\一共有149頁\編輯于星期五（2）ungsystem(尿嘧啶-N-糖基酶系統(tǒng))尿嘧啶有兩種來源：(1)生物體內(nèi)自身存在的U，生物體內(nèi)有dUTPase，但仍有少數(shù)的dUTP滲入DNA鏈中，發(fā)生A?U配對，DNA聚合酶III的校對功能無法識別它。(2)細胞內(nèi)C脫氨氧化生成的U。兩種來源的U都可以通過該系統(tǒng)進行修復包括尿嘧啶－N－糖基酶AP內(nèi)切核酸酶（無嘌呤內(nèi)切核酸酶）DNA聚合酶DNA連接酶尿嘧啶－N－糖基酶：能準確識別新生鏈中的U，并將其切除無嘌呤內(nèi)切核酸酶：切除鄰近核苷酸形成缺口86現(xiàn)在是86頁\一共有149頁\編輯于星期五（2）ungsystem(尿嘧啶-N-糖基酶系統(tǒng))TAGCATCGTAGCA

CGUTAGCung-aseGCUAUTAGCACGApurinase(內(nèi)切酶)TAGCATCGDNApolligase87現(xiàn)在是87頁\一共有149頁\編輯于星期五7.4.2DNA的損傷修復機制造成DNA損傷的因素電離輻射紫外線烷化劑氧化劑…損傷類型胸腺嘧啶二聚體研究得最清楚當有胸腺嘧啶二聚體的DNA作為模板進行復制時，DNA聚合酶將兩個A聚合上去，但由于不能很好地形成氫鍵，由3’5’的校對功能將之水解。此事件反復發(fā)生，從而造成空耗，即大量的的dATP被分解，而DNA復制則毫無進展。由于蛋白質(zhì)在不斷合成，而DNA不能合成，因此細胞不能分裂，出現(xiàn)細絲狀的所謂蛇形細胞，最后導致細胞死亡。88現(xiàn)在是88頁\一共有149頁\編輯于星期五一、嘧啶二聚體的產(chǎn)生類型：TT二聚體（）、CC二聚體（）、CT二聚體（）TTCCCT相鄰的胸腺嘧啶胸腺嘧啶二聚體CCCCCCCC89現(xiàn)在是89頁\一共有149頁\編輯于星期五對于胸腺嘧啶二聚體主要有5種修復途徑：

(1)光修復(2)切除修復(3)重組修復(4)SOS修復(5)二聚體糖基酶修復90現(xiàn)在是90頁\一共有149頁\編輯于星期五phR471aa（1）光修復TTAATT-AATTAATT-AA

發(fā)生在DNA復制前；無誤修復

400nmBluelight&phRgene(photo-reactivationenzyme，光復活酶，471aa)可見光激活光復活酶已在細菌、酵母菌、原生動物、藻類、蛙、鳥類、哺乳動物中的有袋類以及人的淋巴細胞和皮膚成纖維細胞中發(fā)現(xiàn)此修復功能主要是低等生物的一種修復方式91現(xiàn)在是91頁\一共有149頁\編輯于星期五(2)切除修復廣泛存在于原核生物和真核生物中，也是人類的主要修復方式人類的色素性干皮病是由常染色體上的隱性基因控制的一種稀有遺傳疾病?；颊邔﹃柟鈽O為敏感，皮膚癌的發(fā)病率很高原因：切除修復系統(tǒng)失去功能發(fā)生在復制前無誤修復UvrA,B,Cgene

Endonucleases(核酸內(nèi)切酶)Exonuclease(核酸外切酶)DNApolLigase92現(xiàn)在是92頁\一共有149頁\編輯于星期五切割刪除切除修復93現(xiàn)在是93頁\一共有149頁\編輯于星期五核苷酸切除修復94現(xiàn)在是94頁\一共有149頁\編輯于星期五E.coli存活%U.V劑量w.t.UvrA+RecA+RecA+

uvra-reca-uvra-Rec-Agene以某種方式參與DNA損傷修復(3)重組修復95現(xiàn)在是95頁\一共有149頁\編輯于星期五★Rec-A.gene以某種方式參與DNA損傷修復?Rec修復系統(tǒng)比切除修復系統(tǒng)更有效

目前知道

?Uvr系統(tǒng)負責切除二聚體?Rec系統(tǒng)負責消除沒有被切除的二聚體可能造成的后果96現(xiàn)在是96頁\一共有149頁\編輯于星期五發(fā)生在復制后；易錯修復重組修復負責消除那些未被切除的二聚體可能造成的可怕后果在重組修復過程中，二聚體并未除去，而是經(jīng)過多次復制后，二聚體被稀釋，不妨礙正常代謝所需酶在正常的細胞中就存在：

RecA、RecBCD蛋白；DNApolymerase；ligaseRecA蛋白具有催化DNA分子之間的同源聯(lián)會和交換單鏈的功能97現(xiàn)在是97頁\一共有149頁\編輯于星期五RecombinativeRepair(strandtransferrepair)復制修復過程：含有二聚體的損傷DNA仍能復制，但子代DNA鏈在損傷的對應(yīng)部位出現(xiàn)缺口，通過DNA分子間的重組，從完整的親代鏈上把具有相應(yīng)堿基序列的片段轉(zhuǎn)到子鏈的缺口處，然后再聚合核苷酸填補親代鏈的缺口98現(xiàn)在是98頁\一共有149頁\編輯于星期五發(fā)生在復制后；易錯修復SOS修復系統(tǒng)的存在是紫外線誘發(fā)突變的主要原因SOS修復是一種旁路系統(tǒng)，允許新生的DNA鏈越過TT而生長，代價是保真度的極大降低，是一個錯誤潛伏的過程其原則是：喪失某些信息而存活總比死亡好當SOS修復系統(tǒng)被活化后，校對系統(tǒng)大大喪失了識別雙螺旋結(jié)構(gòu)變形的能力，結(jié)束了空耗過程，而使復制繼續(xù)前進SOS系統(tǒng)的酶只有細胞受到損傷時才出現(xiàn)(4)SOS修復^99現(xiàn)在是99頁\一共有149頁\編輯于星期五（2）SOS修復機制SOS修復－－無模板指導的DNA復制大劑量的紫外線照射，大量的二聚體產(chǎn)生SOS系統(tǒng)誘導，錯誤潛伏的復制超越二聚體而進行錯誤堿基100現(xiàn)在是100頁\一共有149頁\編輯于星期五SOS修復系統(tǒng)涉及的2個基因：

recA：編碼RecA蛋白，該蛋白具有三種主要的生物化學活性：一是重組活性；二是單鏈DNA結(jié)合活性；三是蛋白酶活性。在細胞內(nèi)，DNA合成正常進行時，RecA蛋白沒有蛋白酶活性，只有在DNA受到損傷或DNA復制受抑制時RecA蛋白才有活性。RecA蛋白在細胞中有少量存在

lexA：編碼LexA蛋白，是一種阻遏蛋白。該蛋白結(jié)合在SOS系統(tǒng)中各基因的操作子上，阻遏SOS基因的活性101現(xiàn)在是101頁\一共有149頁\編輯于星期五300XDNAdamagedSignal單鏈DNA、寡聚核苷酸RecAcleavesLexASOSUmuCmutationBeforeinducing.LexA-pRec-A,UmuC…11genesNeg.repressionU.V.damageDNASignal(S.S.DNAtailor5NtS.S.DNA)RecA高效表達目的基因表達目的基因被LexA阻遏lexA基因被LexA蛋白部分阻遏recA被LexA蛋白部分阻遏lexA表達但產(chǎn)物無活性機制正常生理狀態(tài)當DNA的損傷被修復，DNA的復制難關(guān)渡過后，RecA的高效表達也停止，LexA的負控制機制重新被啟動，SOS修復系統(tǒng)關(guān)閉。102現(xiàn)在是102頁\一共有149頁\編輯于星期五RecA在SOS修復反應(yīng)中起核心作用RecA與LexA組成調(diào)控環(huán)路DNA損傷SOSRecA受LexA的部分抑制103現(xiàn)在是103頁\一共有149頁\編輯于星期五當DNA復制受阻/DNAdamaged能量大量消耗細胞內(nèi)原少量表達的RecA-p與S.S.DNA結(jié)合激活RecA-p的proteinase活性修復損傷LexA-p降解RecA-p高效表達300timesupSOSopen當DNA正常復制時（無復制受阻，無DNA損傷，無TTdimer）RecA-p不表現(xiàn)proteinase活性104現(xiàn)在是104頁\一共有149頁\編輯于星期五當DNA復制度過難關(guān)后SOSrepair是一種error-prone(傾向差錯)極強的修復機制是進化中形成的“竭盡全力，治病救人”的措施（正常狀態(tài)下，SOS是關(guān)閉的）RecA-p很快消失LexAgeneonSOSoff105現(xiàn)在是105頁\一共有149頁\編輯于星期五（5）突變的形成DNA未經(jīng)修復經(jīng)過修復/校正突變/死亡傾向差錯修復(重組修復，SOS）避免差錯修復(光修復，切補修復)形成突變不形成突變DNAdamaged/mispairing物理誘變，化學誘變，自發(fā)突變是突變發(fā)生的前提106現(xiàn)在是106頁\一共有149頁\編輯于星期五

R/M體系的作用：保護自身的DNA不受限制破壞外源DNA使之迅速降解7.4.3限制與修飾系統(tǒng)

(restrictionandmodificaion)?菌體限制修飾系統(tǒng)中的限制性內(nèi)切酶能將外來DNA切斷?菌體本身的DNA可受甲基化酶的保護（m6A、m5C）

兩者稱為限制-修飾作用107現(xiàn)在是107頁\一共有149頁\編輯于星期五以大腸桿菌為例，在K株和B株中都含有各自不同的限制――修飾系統(tǒng)，兩種不同來源的－噬菌體（lK和lB）長期寄生于各自的宿主細胞中，宿主細胞內(nèi)的甲基化酶已將其染色體DNA和噬菌體DNA特異性的保護，封閉了自身所產(chǎn)生的限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點，故它們在感染相應(yīng)的宿主細胞（K株和B株）時DNA不被降解，因此感染頻率很高。當它們分別感染其他宿主細胞時，由于沒有特異性的保護作用，入侵的DNA分子被宿主細胞的限制性內(nèi)切酶切割降解，從而感染頻率急劇下降，普遍能低一或幾個數(shù)量極。

108現(xiàn)在是108頁\一共有149頁\編輯于星期五修飾的(B)大腸桿菌B限制作用(10-4)限制作用(10-4)大腸桿菌K

修飾的(K)11大腸桿菌寄主控制的限制修飾系統(tǒng)數(shù)字是生長在不同寄主中的噬菌體的成斑率細菌借助限制－修飾系統(tǒng)區(qū)別自己的DNA和外源DNA109現(xiàn)在是109頁\一共有149頁\編輯于星期五自己DNA:限制模式相同的DNA同株系的不同個體DNA、寄生于其中的質(zhì)粒和噬菌體居民DNA(residentDNA)：同一個細胞內(nèi)的不同類型的DNA包括細胞DNA，質(zhì)粒DNA，噬菌體DNA等110現(xiàn)在是110頁\一共有149頁\編輯于星期五(2)細菌中三種不同類型的限制修飾酶目前已經(jīng)鑒定出有三種不同類型的核酸內(nèi)切限制酶，即I型酶、II型酶和III酶。II型酶由于其核酸內(nèi)切酶活性和甲基化作用活性是分開的，而且核酸內(nèi)切酶作用又具有序列特異性，所以在基因克隆中有特別廣泛的用途。限制性內(nèi)切酶：準確裁剪DNA分子的工具111現(xiàn)在是111頁\一共有149頁\編輯于星期五II類限制性核酸內(nèi)切酶是Smith等人于1968年在流感嗜血桿菌d型菌株中發(fā)現(xiàn)的。該類酶是一種分子量較小的單體蛋白，其雙DNA的識別與切割活性僅需要Mg2+，且識別與切割位點的序列大都具有嚴格的特異性，因而在DNA重組實驗中廣泛使用。

目前已分離出400余種II類限制性核酸內(nèi)切酶，鑒定識別及切割位點的有300多種，商品化的酶NEB（NewEnglandBiolabs）公司品種最多，達220余種，其中在DNA重組實驗中常用的有20多種。

112現(xiàn)在是112頁\一共有149頁\編輯于星期五限制性內(nèi)切酶的類型113現(xiàn)在是113頁\一共有149頁\編輯于星期五114現(xiàn)在是114頁\一共有149頁\編輯于星期五II型核酸內(nèi)切酶的基本特性：絕大多數(shù)的II型核酸內(nèi)切酶都能識別由4～8個核苷酸組成的核苷酸序列（識別序列），識別序列具有回文結(jié)構(gòu)，如EcoRI(5’-GAATTC-3’)、PstI(5’-CTGCA-3’)等115現(xiàn)在是115頁\一共有149頁\編輯于星期五116現(xiàn)在是116頁\一共有149頁\編輯于星期五同裂酶(isoschizomers)：有些II型核酸內(nèi)切酶的識別位點的序列相同，但切點不一定相同，這些酶稱為同裂酶。如：HpaII和MspI是一對同裂酶，靶序列是CCGGHpaII--CCGG--MspI--GGCC--XmaI--C↓CCGGG--SmaI--CCC↓GGG--117現(xiàn)在是117頁\一共有149頁\編輯于星期五GGATCCCCTAGG同尾末端酶BglIIIBamHIAGATCTTCTAGA

GATCCGATCTAGAGATCCTCTAGG

同尾酶(isocaudamer)：有些II型核酸內(nèi)切酶作用后產(chǎn)生的DNA粘性末端相同、識別位點的序列不一定相同，這些酶稱為同尾酶如BamHI、BclI、BalII、Sau3AI和XhoII118現(xiàn)在是118頁\一共有149頁\編輯于星期五核酸內(nèi)切酶的命名法酶的基本名稱：屬名的第一個字母（大寫），種名的第一，二個字母（小寫）。如大腸桿菌(Escherichiacoli)，用Eco表示，流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)用Hin表示用一個寫在右下方的標注字母代表菌株或型，如Ecok大寫的羅馬數(shù)字，來區(qū)分同種微生物中不同限制與修飾體系的內(nèi)切酶，如流感嗜血菌Rd菌株的幾個限制修飾體系分別表示為HinI、HinII、HinIII等系統(tǒng)名稱R，M119現(xiàn)在是119頁\一共有149頁\編輯于星期五限制性核酸內(nèi)切酶在基因工程屬常用工具酶，主要用于基因物理圖譜的繪制、基因片段的鑒定或獲得、用于雜交的DNA探針的制備等，而酶切的條件控制則是非常重要的。120現(xiàn)在是120頁\一共有149頁\編輯于星期五在DNA的酶切反應(yīng)中酶切條件是酶切成功的關(guān)鍵，主要影響因素有：

（1）反應(yīng)溫度

常規(guī)酶切反應(yīng)均在37℃進行，但有些酶的最佳反應(yīng)溫度并不是此溫度，如SmaI，最適反應(yīng)溫度為30℃，故最好根據(jù)所選用的酶確定反應(yīng)溫度。當采用聯(lián)合酶切進行實驗時尤其要注意選擇的反應(yīng)溫度是否都滿足兩者的要求，如果有一個酶的最適溫度不符，建議分步酶切

121現(xiàn)在是121頁\一共有149頁\編輯于星期五（2）緩沖體系

廠商提供的限制性核酸內(nèi)切酶有其相對應(yīng)的緩沖液，一般的緩沖液種類為4-10種左右，按鹽離子濃度可分為三大類：高鹽、中鹽和低鹽。緩沖液配制為10×的母液，酶切時稀釋10倍。常規(guī)酶切中均選用最佳緩沖液進行酶切反應(yīng)，但聯(lián)合酶切時，根據(jù)廠商提供的聯(lián)合酶切的緩沖液選擇表（寶生物工程公司）選擇緩沖液或采用萬能緩沖液（Promega）

122現(xiàn)在是122頁\一共有149頁\編輯于星期五3）反應(yīng)時間

常規(guī)酶切反應(yīng)時間為1.5小時，但可根據(jù)酶切對象和酶的用量將保溫時間延長2～3小時，有時甚至可以過夜。一般來說，在DNA量固定的前提下，長時間酶切所需的酶量可適當減少，所以在大劑量酶切DNA時，可以考慮酶切過夜。另對特殊實驗，如對基因組DNA進行部分酶切，則在酶量投入一定的前提下，減少反應(yīng)時間降低對DNA切割的程度。

123現(xiàn)在是123頁\一共有149頁\編輯于星期五（4）加入酶量

在底物（DNA）一定的條件下，酶量投入越多則酶切效果越好。但實驗中常常出現(xiàn)酶量加入過多酶切效果卻反而差的現(xiàn)象，這主要是酶的儲存液中含有50％的甘油，但酶量加入過多，超過酶反應(yīng)體系的10％時，過多的甘油抑制了限制性內(nèi)切酶活性。因此，在酶切反應(yīng)時，酶量的加入原則：不超過反應(yīng)總體積的10％，在能切開的條件下加入越少越好（可減少酶的Star活性）。124現(xiàn)在是124頁\一共有149頁\編輯于星期五（5）DNA純度

在滿足上述條件下影響酶切效果的主要因素是DNA的純度，DNA樣品中蛋白含量過高、有機溶劑（苯酚或氯仿）的殘留、高濃度的RNA等。另外DNA濃度過高也會導致酶切失敗，一般DNA的質(zhì)量濃度在1mg/ml體系中能取得好的酶切效果。當發(fā)生不明原因的酶切失敗時，常用的解決方法是采用稀釋酶切，即將酶切體系放大（如從15ul-->30ul），將雜質(zhì)相對濃度稀釋，這樣不需多增加酶量就能取得較好的酶切效果

125現(xiàn)在是125頁\一共有149頁\編輯于星期五酶切方式可分為部分酶切與完全酶切：

（1）部分酶切

指的是同一DNA片段上的位點有些被切開而另一些未被切開，此法主要用于基因的克隆。在某些基因內(nèi)部可能有此酶的切點，用完全酶切進行克隆時難以得到完整基因。部分酶切實施方法：a）在不同的時間從同一個酶反應(yīng)管中取樣終止反應(yīng)，利用時間控制酶切程度，該方法比較繁瑣，不易掌握得恰到好處；b）固定酶切的反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間，控制酶的投入量，一般是在反應(yīng)管中加入不等量稀釋的酶，利用不同酶濃度控制酶切程度，該方法因易控制而被廣泛應(yīng)用。

（2）完全酶切

適用于除目的基因克隆以外的絕大多數(shù)DNA操作，例如載體的切割，酶切圖譜的制作，基因的鑒定與DNA片段的分離等。

126現(xiàn)在是126頁\一共有149頁\編輯于星期五在DNA重組實驗中，經(jīng)常會用雙酶切（甚至是3個酶切鑒定）鑒定重組子或獲得不同粘性末端的DNA片段，而在廠商提供的聯(lián)合酶切緩沖液表中并不包括所有類型的酶，即使提供了“萬能緩沖液”，有些酶的聯(lián)合酶切也不一定能取得比較好的效果。解決方法：

（1）分步酶切法

對將進行的兩種酶的酶切采用分步的方法，即先選擇一個酶，采用此酶的最佳反應(yīng)條件進行酶切，然后選用第二個酶進行最佳反應(yīng)。此方法通用性較強，聯(lián)合酶切也比較完全，但較耗時。

（2）

同步酶切法

取兩種酶的最佳緩沖液各50％加入到酶切反應(yīng)體系中，并同時加入兩種酶進行反應(yīng)。特別是對不同廠商提供的酶進行聯(lián)合酶切時，即可節(jié)約時間也可取得比較好的酶切效果。

127現(xiàn)在是127頁\一共有149頁\編輯于星期五酶切失敗的原因及處理辦法

酶切失敗主要表現(xiàn)為兩方面：

（1）不完全酶切甚至是DNA基本未發(fā)生酶切；主要原因有：a）緩沖體系不合適，可進行重新酶切；b）酶量加入過多而導致甘油抑制酶活，可將反應(yīng)體系適當稀釋；c）DNA樣品雜質(zhì)含量高，可采用稀釋酶切或?qū)NA樣品重新抽提后酶切

（2）DNA被降解（不成帶狀）；主要原因是DNA樣品中含有痕量的DNA酶，建議重新抽提除去DNA酶。

128現(xiàn)在是128頁\一共有149頁\編輯于星期五BamHISacIBamHI/SacI雙酶切BamHI/SacI雙酶切BamHISacI連接PCR產(chǎn)物

129現(xiàn)在是129頁\一共有149頁\編輯于星期五7.4.4基因的回復突變（backmutation/reversemutation）(1)回復突變的概念野生型突變體mutation(lowF.)backmutation(verylowF.)(2)抑制突變的概念突變體所失去的野生型性狀通過第二次突變得到回復，第二次突變稱為回復突變第二點回復突變并沒有真正改變正向突變的DNA的堿基序列，只是正向突變的突變效應(yīng)被抑制了，因此第二點回復突變又稱為抑制突變抑制突變分為兩類：A.基因內(nèi)抑制突變(intragenicsuppresor)B.基因間抑制突變(intergenicsuppresor)130現(xiàn)在是130頁\一共有149頁\編輯于星期五間接抑制突變:不恢復正向突變基因蛋白質(zhì)產(chǎn)物的功能，而是通過改變其它蛋白質(zhì)的性質(zhì)或表達水平而補償原來突變造成的缺陷，從而恢復野生型

野生表型恢復作用的性質(zhì)直接抑制突變:通過恢復或部分恢復原來突變基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的功能而恢復野生表型131現(xiàn)在是131頁\一共有149頁\編輯于星期五A.基因內(nèi)抑制突變抑制突變發(fā)生在正向突變的基因中錯義突變和移框突變都可以被基因內(nèi)另一位點的突變所抑制由于處于同一基因中，正向突變和抑制突變一般緊密連鎖，因此常把基因內(nèi)抑制突變當成真正的原點回復突變錯義突變造成野生型表型的喪失－－部分原因在于影響到蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)(正負電荷、疏水作用)132現(xiàn)在是132頁\一共有149頁\編輯于星期五a、靜電作用錯義突變的基因內(nèi)抑制突變133現(xiàn)在是133頁\一共有149頁\編輯于星期五b、疏水作用錯義突變的基因內(nèi)抑制突變134現(xiàn)在是134頁\一共有149頁\編輯于星期五移框突變的抑制突變(基因內(nèi)第二點的插入或缺失)135現(xiàn)在是135頁\一共有149頁\編輯于星期五B.基因間抑制突變正向突變的無義突變、錯義突變和移框突變都可以被另一基因上的突變所抑制，這些抑制突變分別稱為無義抑制突變、錯義抑制突變和移框抑制突變抑制突變發(fā)生在tRNA基因或與tRNA功能有關(guān)的基因上，這些基因又稱為抑制基因抑制tRNA：能抑制正向突變表型的突變了的tRNA抑制tRNA是自發(fā)突變或誘發(fā)突變的結(jié)果，而不是細胞對于無義突變應(yīng)答的產(chǎn)物。抑制突變發(fā)生在正向突變基因外其它的基因中136現(xiàn)在是136頁\一共有149頁\編輯于星期五在編碼蛋白質(zhì)的基因中，無義突變的發(fā)生頻率很高，如AAG、CAG、GAG、UCG、UGG、UAC、UAU中任何一個密碼子都可以通過一次堿基替代突變而產(chǎn)生無義密碼子，使肽鏈合成提前終止

無義密碼子有三種UAG、UAA和UGA，相應(yīng)的無義抑制突變也有三種：

琥珀型抑制突變：產(chǎn)生識別UAG的抑制tRN