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Westernblot實(shí)驗(yàn)技術(shù)
張蓓精選課件WesternBlot基本原理
在電場(chǎng)的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來(lái)檢測(cè)。精選課件一、實(shí)驗(yàn)原理WesternBlot法又稱免疫印跡法（IBT），分三個(gè)階段進(jìn)行。第一階段：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）。第二階段：電轉(zhuǎn)移。第三階段：固相酶免疫測(cè)定。精選課件精選課件三、固相酶免疫測(cè)定檢測(cè)ENA自身抗體精選課件（一）原理精選課件精選課件（二）材料1、洗滌液：含0.05％吐溫-20的pH7.4的PBS2、酶標(biāo)抗人IgG3、陰性對(duì)照血清、陽(yáng)性對(duì)照血清4、底物溶液5、終止液6、恒溫?fù)u床、微量加樣器、反應(yīng)槽、塑料袋、滴管、吸管等。
精選課件精選課件（三）方法
1．次日取出已封閉的NC膜，用洗滌液漂洗5次，每次1min。2.將剪下條帶放入反應(yīng)槽中，加入1ml洗滌液，再已加入20μl血清混勻，37℃恒溫?fù)u動(dòng)40min。3．取出洗滌液漂洗5次，每次1min。4．加入1ml酶標(biāo)羊抗人IgG，37℃恒溫?fù)u動(dòng)30min。5．取出洗滌液漂洗5次，每次1min。6．加入底物液1ml，顯色10min。7．加入終止液終止反應(yīng)。精選課件精選課件結(jié)果判斷用肉眼觀察。出現(xiàn)染色條帶為陽(yáng)性，不出現(xiàn)染色條帶為陰性，不同的疾病可以出現(xiàn)不同的條帶。跟據(jù)條帶位置判斷結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)：1．抗Sm抗體：同時(shí)出現(xiàn)29KD、28KD、13.5KD條帶。2．抗SSA抗體：60KD、52KD任意出現(xiàn)一條帶。3．抗SSB抗體：47KD、45KD應(yīng)用時(shí)出現(xiàn)條帶。4．抗Jo-1抗體：5
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