原核基因表達(dá)調(diào)控模式

原核基因表達(dá)調(diào)控模式第1頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4

基因表達(dá)(geneexpression)是指生物基因組中結(jié)構(gòu)基因所攜帶的遺傳信息經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯等一系列過(guò)程，合成特定的物質(zhì)，進(jìn)而發(fā)揮其特定的生物學(xué)功能和生物學(xué)效應(yīng)的全過(guò)程。對(duì)這個(gè)過(guò)程的調(diào)節(jié)就稱為基因表達(dá)調(diào)控（generegulation或genecontrol）。生物學(xué)意義：適應(yīng)環(huán)境、維持生長(zhǎng)和增殖；維持個(gè)體發(fā)育和分化。第2頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4第3頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4原核生物和真核生物都能夠根據(jù)周圍環(huán)境(如溫度、營(yíng)養(yǎng)成分等)的變化，改變自己的代謝方式。而代謝方式的變化通常可以通過(guò)對(duì)基因表達(dá)過(guò)程的調(diào)控得以實(shí)現(xiàn)。機(jī)體可以在基因表達(dá)過(guò)程的任何階段進(jìn)行調(diào)控，一般以轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控為主。第4頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4原核生物細(xì)胞的基因和蛋白質(zhì)種類較少，如大腸桿菌基因組約為4.60×106bp共有4288個(gè)可以框架。據(jù)估計(jì)，一個(gè)細(xì)胞中總共含有107個(gè)蛋白質(zhì)分子。如果每個(gè)基因等同翻譯的話，任何一個(gè)多肽應(yīng)有2500拷貝。但是，這些蛋白質(zhì)并不是以相同拷貝數(shù)存在于每個(gè)細(xì)胞中的，有些蛋白質(zhì)的數(shù)目相當(dāng)固定，另一些則變化很大。第5頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞有約15000個(gè)核糖體，50種核糖體蛋白、糖酵解體系的酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等都是代謝過(guò)程中必需的，其合成速率不受環(huán)境變化或代謝狀態(tài)的影響，這一類蛋白質(zhì)被稱為永久型（constitutive）合成的蛋白質(zhì)。第6頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4另一類則被稱為適應(yīng)型或調(diào)節(jié)型（adaptiveorregulated），因?yàn)檫@類蛋白質(zhì)的合成速率明顯地受環(huán)境的影響而改變。如大腸桿菌細(xì)胞中一般只有15個(gè)β-半乳糖苷酶，但若將細(xì)胞培養(yǎng)在只含乳糖的培養(yǎng)基中，每細(xì)胞中這個(gè)酶的量可高達(dá)幾萬(wàn)個(gè)分子。第7頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/47.1.1基因表達(dá)調(diào)控的基本概念順式作用元件：對(duì)基因表達(dá)有調(diào)節(jié)活性的DNA序列，其活性只影響與其自身同在一個(gè)DNA分子上的基因；順式作用元件通常不編碼蛋白質(zhì)，多位于基因旁或內(nèi)含子中。如啟動(dòng)子、終止子、操縱基因等。7.1原核基因表達(dá)調(diào)控總論第8頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4反式作用因子：通過(guò)擴(kuò)散自身表達(dá)產(chǎn)物（酶、調(diào)節(jié)蛋白）控制其他基因的表達(dá),反式作用因子通常為的蛋白質(zhì)或RNA。如調(diào)控蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等。基因表達(dá)的調(diào)控主要通過(guò)反式作用因子和順式作用元件相互識(shí)別、相互作用而實(shí)現(xiàn)。第9頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4轉(zhuǎn)錄因子（transcriptionfactor）是轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程中RNA聚合酶所需要的輔助因子。轉(zhuǎn)錄因子是參與正調(diào)控的反式作用因子，在無(wú)轉(zhuǎn)錄因子時(shí)，RNA聚合酶不能起始轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子通常識(shí)別位于基因上游啟動(dòng)子附近的順式作用元件。第10頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4基因表達(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)在以下二方面：轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控(transcriptionalregulation)；轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控（post-transcriptionalregulation），包括（1）mRNA加工成熟水平調(diào)控（differentialprocessingofRNAtranscrpt）；（2）翻譯水平調(diào)控（differentialtranslationofmRNA）。第11頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4

基因調(diào)控的指揮系統(tǒng)也是多樣的，不同的生物使用不同的信號(hào)來(lái)指揮基因調(diào)控。原核生物中，營(yíng)養(yǎng)狀況(nutritionalstatus)和環(huán)境因素(environmentfactor)對(duì)基因表達(dá)起著舉足輕重的影響。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平和發(fā)育階段是基因表達(dá)調(diào)控的最主要手段，營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境因素的影響力大為下降。第12頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控決定于DNA的結(jié)構(gòu)、RNA聚合酶的功能、蛋白因子及其他小分子配基的相互作用。細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄與翻譯過(guò)程幾乎發(fā)生在同一時(shí)間間隔內(nèi)，轉(zhuǎn)錄與翻譯相耦聯(lián)（coupledtranscriptionandtranslation）。真核生物中，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（primarytranscript）只有從核內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)到核外，才能被核糖體翻譯成蛋白質(zhì)。第13頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4第14頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4原核生物的基因調(diào)控主要是轉(zhuǎn)錄調(diào)控，包括負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控和正轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是阻遏蛋白（repressor），阻止結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄。根據(jù)其作用特征又分為負(fù)控誘導(dǎo)和負(fù)控阻遏兩大類。7.1.2原核基因的調(diào)控分類第15頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4在負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)中，阻遏蛋白不與效應(yīng)物（誘導(dǎo)物）結(jié)合時(shí)，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄；在負(fù)控阻遏系統(tǒng)中，阻遏蛋白與效應(yīng)物結(jié)合時(shí)，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄。阻遏蛋白作用于操縱區(qū)。第16頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4在正轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是激活蛋自(activator)。也可根據(jù)激活蛋白的作用性質(zhì)分為正控誘導(dǎo)系統(tǒng)和正控阻遏系統(tǒng)。在正控誘導(dǎo)系統(tǒng)中，效應(yīng)物分子(誘導(dǎo)物)的存在使激活蛋白處于活性狀態(tài)；在正控阻遏系統(tǒng)中，效應(yīng)物分子的存在使激活蛋白處于非活性狀態(tài)。第17頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4細(xì)菌中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控體系：(a)負(fù)控誘導(dǎo)體系；(b)正控誘導(dǎo)體系第18頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4細(xì)菌中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控體系：(c)負(fù)控阻遏體系；(d)正控阻遏體系第19頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4

參與大腸桿菌中基因表達(dá)調(diào)控最常見的蛋白質(zhì)可能是σ因子，基因組序列分析后發(fā)現(xiàn)至少存在六種σ因子。除σ54外，因子在結(jié)構(gòu)上具有同源性，統(tǒng)稱σ70家族，含有4個(gè)保守區(qū)，其中第2個(gè)和第4個(gè)保守區(qū)參與結(jié)合啟動(dòng)區(qū)DNA，第2個(gè)保守區(qū)的另一部分還參與雙鏈DNA解開成單鏈的過(guò)程。第20頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4

大腸桿菌中的б因子(以б70為例)主要包括四個(gè)結(jié)構(gòu)域。第21頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4σ54因子識(shí)別并與DNA上的-24和-12區(qū)相結(jié)合。σ70啟動(dòng)子只有在核心酶結(jié)合到DNA鏈上之后才能與啟動(dòng)子區(qū)相結(jié)合，而σ54則類似于真核生物的TATA區(qū)結(jié)合蛋白（TBP），可以在無(wú)核心酶時(shí)獨(dú)立結(jié)合到啟動(dòng)子上。第22頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4σ70

（上）和σ54

（下）因子識(shí)別并結(jié)合在所調(diào)控基因上游的不同區(qū)域。第23頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/47.1.3原核基因調(diào)控的主要特點(diǎn)

原核生物通過(guò)特殊代謝物調(diào)節(jié)基因活性主要分為可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)和可阻遏調(diào)節(jié):1.可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)

是指一些基因在特殊的代謝物或化合物的作用下，由原來(lái)關(guān)閉的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣ぷ鳡顟B(tài)，即在某些物質(zhì)的誘導(dǎo)下使基因活化。這類基因中最突出的例子是大腸桿菌的乳糖操縱子。第24頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4大腸桿菌在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，在只含乳糖的培養(yǎng)基中開始時(shí)生長(zhǎng)不好，直到合成了能夠利用乳糖的一系列酶，具備了利用乳糖作為碳源的能力才開始生長(zhǎng)。第25頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4細(xì)菌獲得這一能力的原因就是因?yàn)樵谡T導(dǎo)物乳糖的誘導(dǎo)下啟動(dòng)了乳糖操縱子，表達(dá)它所編碼的3個(gè)酶:β-半乳糖苷酶使乳糖水解為半乳糖和葡萄糖)，β-半乳糖苷透過(guò)酶(使乳糖進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi))，β-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶(使β-半乳糖第六位碳原子乙?；?。因此，這類基因被稱為可誘導(dǎo)基因，這類酶被稱為誘導(dǎo)酶，這個(gè)生物化學(xué)過(guò)程被稱為酶的誘導(dǎo)合成。第26頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4

2.可阻遏調(diào)節(jié)這類基因平時(shí)都是開啟的，處在產(chǎn)生蛋白質(zhì)或酶的工作過(guò)程中，由于一些特殊代謝物或化合物的積累而將其關(guān)閉，阻遏了基因的表達(dá)。比如大腸桿菌生活中必須有色氨酸，一般情況下，該操縱子是開啟的。如果在細(xì)菌培養(yǎng)基中加入色氨酸，使之能利用培養(yǎng)基中的色氨酸來(lái)維持生活而不需要再費(fèi)力去合成，細(xì)菌往往能在2-3min內(nèi)完全關(guān)閉該操縱子。第27頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4這就是說(shuō)，某一代謝途徑最終產(chǎn)物合成酶的基因可以被這個(gè)產(chǎn)物本身所關(guān)閉。這種基因被稱為可阻遏基因，這些酶被稱為可阻遏酶，這個(gè)現(xiàn)象被稱為可阻遏現(xiàn)象，這些起阻遏作用的小分子被稱為阻遏物。在這里，色氨酸或與其代謝有關(guān)的某種物質(zhì)在阻遏過(guò)程(而不是誘導(dǎo)過(guò)程)中起作用。第28頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/47.1.4弱化子對(duì)基因活性的影響在這種調(diào)節(jié)方式中，起信號(hào)作用的是有特殊負(fù)載的氨基酰-tRNA的濃度，在色氨酸操縱子中就是色氨基酰-tRNA的濃度。當(dāng)操縱子被阻遏，RNA合成被終止時(shí)，起終止轉(zhuǎn)錄信號(hào)作用的那一段核苷酸被稱為弱化子。這種因?yàn)楹颂求w在基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上的不同位置，決定了RNA可以形成哪一種形式的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并由此決定基因能否繼續(xù)轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)方式確實(shí)是非常巧妙的。第29頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4葡萄糖存在的情況下，即使在細(xì)苗培養(yǎng)基中加入乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麥芽糖等誘導(dǎo)物，與其相對(duì)應(yīng)的操縱子也不會(huì)啟動(dòng)，不會(huì)產(chǎn)生出代謝這些糖的酶來(lái)，這種現(xiàn)象稱為葡萄糖效應(yīng)或降解物抑制作用。出現(xiàn)這種效應(yīng)的原因是添加葡萄糖后，細(xì)菌所需要的能量便可從葡萄糖得到滿足，葡萄糖是最方便的能源，細(xì)菌無(wú)需開啟一些不常用的基因去利用這些稀有的糖類。7.1.5降解物對(duì)基因活性的影響第30頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4葡萄糖的存在會(huì)抑制細(xì)菌的腺苷酸環(huán)化酶活性，減少環(huán)腺苷酸cAMP的合成，與它相結(jié)合的蛋白質(zhì)—環(huán)腺苷酸受體蛋內(nèi)(CRP)又稱分解代謝物激活蛋白(CAP)，因找不到配體而不能形成復(fù)合物。降解物抑制作用是通過(guò)提高轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的，是一種積極的調(diào)節(jié)方式。第31頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4細(xì)菌有時(shí)會(huì)碰到緊急狀況，比如氨基酸饑餓時(shí)，即氨基酸的全面匾乏。為了緊縮開支，渡過(guò)難關(guān)，細(xì)菌將會(huì)產(chǎn)生一個(gè)應(yīng)急反應(yīng)，包括生產(chǎn)各種RNA、糖、脂肪和蛋白質(zhì)在內(nèi)的幾乎全部生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程均被停止。實(shí)施這一應(yīng)急反應(yīng)的信號(hào)是鳥苷四磷酸(ppGpp)和鳥苷五磷酸(pppGpp)。產(chǎn)生這兩種物質(zhì)的誘導(dǎo)物是空載tRNA。7.1.6細(xì)菌的應(yīng)急反應(yīng)第32頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4當(dāng)氨基酸饑餓時(shí)，細(xì)胞中便存在大量的不帶氨基酸的tRNA，這種空載的tRNA會(huì)激活焦磷酸轉(zhuǎn)移酶，使ppGpp大量合成，其濃度可增加10倍以上。ppGpp的出現(xiàn)會(huì)關(guān)閉許多基因，當(dāng)然也會(huì)打開一些合成氨基酸的基因，以應(yīng)付這種緊急狀況。第33頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/41961年，Jacob和Monod提出了細(xì)菌基因表達(dá)調(diào)控的模型——操縱子學(xué)說(shuō)，解釋了原核生物的基因表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上是如何調(diào)控的。操縱子：是基因表達(dá)的協(xié)調(diào)單位，由啟動(dòng)子、操縱基因及其所控制的一組功能上相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因所組成。操縱基因受調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物的控制。7.2乳糖操縱子與負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)第34頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4（一）操縱子(operon)的基本組成結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、操縱基因、啟動(dòng)子、終止子lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacI第35頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4

(1)結(jié)構(gòu)基因(structuralgene)是編碼蛋白質(zhì)或RNA的一段DNA序列。結(jié)構(gòu)基因編碼大量的功能各異的蛋白質(zhì)。特點(diǎn)：（1）含有2個(gè)以上的基因（2）各結(jié)構(gòu)基因串連排列，組成結(jié)構(gòu)基因群lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacI第36頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4（3）多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的DNA被轉(zhuǎn)錄成多順反子mRNA（4）每個(gè)結(jié)構(gòu)基因是一個(gè)連續(xù)的開放讀框（5）至少在第一個(gè)開放讀框5’側(cè)具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)，核糖體識(shí)別并結(jié)合，起始翻譯。UAAAUGAUGUAA…...3’第37頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4(2)調(diào)節(jié)基因（regulatorygene）（a）概念：

(regulatorgene)僅指參與其他基因表達(dá)調(diào)控的RNA和蛋白質(zhì)的編碼基因。lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacImRNA第38頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4（b）調(diào)控蛋白類型：阻遏蛋白（repressiveprotein）與操縱元件結(jié)合后能減弱或阻止所調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控蛋白。激活蛋白（activatingprotein）與操縱元件結(jié)合后能增強(qiáng)或啟動(dòng)所調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控蛋白。第39頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4(3)操縱基因(operatorgene)通過(guò)與調(diào)節(jié)基因編碼的阻遏子結(jié)合或脫離而控制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄與否的核苷酸序列。位于結(jié)構(gòu)基因附近，本身不能轉(zhuǎn)錄成mRNA。lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacI第40頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/44、啟動(dòng)子(promoter)

是指能被RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。（1）-10序列---Pribnow盒：TATAAT；（2）-35bp序列：TTGACA操縱子至少有一個(gè)啟動(dòng)子，一般在第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因5’上游，控制整個(gè)結(jié)構(gòu)基因群的轉(zhuǎn)錄第41頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/45、終止子（terminator）是給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNA序列（1）不依賴ρ因子的終止子（2）依賴ρ因子的終止子在一個(gè)操縱元中至少在結(jié)構(gòu)基因群最后一個(gè)基因的后面有一個(gè)終止子第42頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacI(二)乳糖操縱子（1）組成：5種元件由1個(gè)調(diào)節(jié)基因，3個(gè)結(jié)構(gòu)基因、控制元件、啟動(dòng)子和終止子組成。第43頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4第44頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/41、結(jié)構(gòu)基因（1）lacZ：編碼β-半乳糖苷酶

（使乳糖水解）（2）lacY：編碼β-半乳糖苷透過(guò)酶（使β-半乳糖苷透過(guò)細(xì)胞壁、質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)）（3）lacA：編碼β-半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶（將乙?；D(zhuǎn)移到β-半乳糖苷上）2、啟動(dòng)子：

Plac：控制

lacZ,lacY,lacA；多順反子的mRNA3、終止子第45頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/44、調(diào)節(jié)基因lacI：編碼阻遏蛋白（repressiveprotein）亞基

四聚體存在時(shí)具有活性，與Olac具有很強(qiáng)的親和力。lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacI第46頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/45、控制元件Olac

（1）28bp的回文結(jié)構(gòu)，可形成十字形結(jié)構(gòu)

（2）這種結(jié)構(gòu)正好與由四個(gè)相同亞基組成的阻遏蛋白相匹配。第47頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4lac操縱子主要成分分析第48頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4-50-30-1010130-20-4020lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacImRNA（三）乳糖操縱子的負(fù)調(diào)控培養(yǎng)基不含乳糖—lacZ、lacY、lacA低表達(dá)第49頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4（三）乳糖操縱子的負(fù)調(diào)控1、阻遏蛋白與操縱元件結(jié)合2、阻礙了RNA聚合酶與啟動(dòng)子Plac的結(jié)合3、轉(zhuǎn)錄不能進(jìn)行4、lacZ，lacY、lacA低表達(dá)第50頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacImRNAInducer（異構(gòu)乳糖）lactose分解lactose（四）乳糖操縱子與負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)培養(yǎng)基含乳糖---lacZ等高表達(dá)第51頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4（四）乳糖操縱子與負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)1、阻遏蛋白與異構(gòu)乳糖結(jié)合2、阻遏蛋白構(gòu)象變化，不能與操縱子序列結(jié)合3、RNA聚合酶與lac啟動(dòng)子結(jié)合4、lacZ，lacY，lacA的轉(zhuǎn)錄可順利進(jìn)行第52頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/47.2.1酶的誘導(dǎo)—lac體系受調(diào)控的證據(jù)一般情況下，lac+基因型大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶和透過(guò)酶的濃度很低，每個(gè)細(xì)胞只有1～2個(gè)酶分子。但是，在乳糖培養(yǎng)基上酶的濃度很快達(dá)到細(xì)胞總蛋白量的6%或7%，超過(guò)105個(gè)酶分子/細(xì)胞。第53頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4在無(wú)葡萄糖有乳糖的培養(yǎng)基中，lac+細(xì)菌中將同時(shí)合成β-半乳糖苷酶和透過(guò)酶。用32P標(biāo)記的mRNA與模板DNA進(jìn)行定量分子雜交，表明培養(yǎng)基中加入乳糖1～2分鐘后，編碼β-半乳糖苷酶和透過(guò)酶的lacmRNA量就迅速增加，去掉乳糖后，lacmRNA量立即下降。第54頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4lac體系的“開-關(guān)”特性加入乳糖以后，1min內(nèi)出現(xiàn)lacmRNA，稍后即產(chǎn)生β-半乳糖苷酶和透過(guò)酶。當(dāng)移去乳糖后，lacmRNA總量立即下降，兩種酶活性卻由于蛋白質(zhì)半衰期較長(zhǎng)而在相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)維持恒定。第55頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4實(shí)驗(yàn)室常用兩種乳糖類似物—異丙基巰基半乳糖苷（IPTG）和巰甲基半乳糖苷（TMG），在酶活性分析中常用發(fā)色底物O-硝基半乳糖苷（ONPG）。因?yàn)樗鼈兌疾皇前肴樘擒彰傅牡孜铮杂址Q為安慰性誘導(dǎo)物（gratuitousinducer）。第56頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4第57頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4用35S標(biāo)記大腸桿菌細(xì)胞（培養(yǎng)基中沒有半乳糖），將這些帶有放射性的細(xì)菌轉(zhuǎn)移到不含35S的培養(yǎng)基中，加入誘導(dǎo)物后β-半乳糖苷酶便開始合成。分離純化β-半乳糖苷酶，發(fā)現(xiàn)這種酶無(wú)35S標(biāo)記，說(shuō)明這種酶是加入誘導(dǎo)物后新合成的。第58頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/47.2.2操縱子模型及其影響因子Jacob和Monod認(rèn)為誘導(dǎo)酶（他們當(dāng)時(shí)稱為適應(yīng)酶）現(xiàn)象是個(gè)基因調(diào)控問題，而且可以用實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行研究，他們通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)及分析，建立了現(xiàn)在已經(jīng)被人們廣泛接受的乳糖操縱子的控制模型。第59頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4

lac操縱子調(diào)控模型第60頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4A.Z、Y、A基因產(chǎn)物由同一條多順反子mRNA分子所編碼。B.該mRNA分子的啟動(dòng)區(qū)（P）位于阻遏基因（I）與操縱區(qū)（O）之間，不能單獨(dú)起始半乳糖苷酶和透過(guò)酶基因的高效表達(dá)。C.操縱區(qū)是DNA上的一小段序列（僅為26bp），是阻遏物的結(jié)合位點(diǎn)。第61頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4D.當(dāng)阻遏物與操縱區(qū)相結(jié)合時(shí)，lacmRNA的轉(zhuǎn)錄起始受到抑制。E.誘導(dǎo)物通過(guò)與阻遏物結(jié)合，改變其三維構(gòu)象，使之不能與操縱區(qū)相結(jié)合，誘發(fā)lacmRNA的合成。第62頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4培養(yǎng)基中有無(wú)誘導(dǎo)物對(duì)lacmRNA及β-半乳糖苷酶活性的影響第63頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4阻遏物lacI基因產(chǎn)物及功能lac操縱子阻遏物mRNA是由弱啟動(dòng)子控制下永久型合成的，該阻遏蛋白有4個(gè)相同的亞基，每個(gè)亞基均含有347個(gè)氨基酸殘基，并能與1分子IPTG結(jié)合，每個(gè)細(xì)胞中有5～10個(gè)阻遏物分子。第64頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4β-半乳糖苷酶在乳糖代謝中的作用是把前者分解成葡萄糖及半乳糖。如果將葡萄糖和乳糖同時(shí)加入培養(yǎng)基中，大腸桿菌在耗盡外源葡萄糖之前不會(huì)誘發(fā)lac操縱子。第65頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4當(dāng)葡萄糖和乳糖同時(shí)存在于培養(yǎng)基中時(shí)，lac啟動(dòng)子表達(dá)受阻，沒有β-半乳糖苷酶活性；當(dāng)葡萄糖消耗以后(圖中箭頭處)，細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度增加，β-半乳糖苷酶活性增加，一度停止生長(zhǎng)的細(xì)胞又恢復(fù)分裂。第66頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4某大腸桿菌突變體，它不能將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為下一步代謝中間物，該細(xì)菌的lac基因能在葡萄糖存在時(shí)被誘導(dǎo)合成。所以，不是葡萄糖而是它的某些降解產(chǎn)物抑制lacmRNA的合成，科學(xué)上把葡萄糖的這種效應(yīng)稱之為代謝物阻遏效應(yīng)（cataboliterepression）。第67頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4

cAMP與代謝物激活蛋白cAMP是在腺苷酸環(huán)化酶的作用下由ATP轉(zhuǎn)變而來(lái)的，在真核生物的激素調(diào)節(jié)過(guò)程中也起著十分重要的作用。將細(xì)菌放在含葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，cAMP的濃度就低；如果培養(yǎng)基中只有甘油或乳糖等不進(jìn)行糖酵解途徑的碳源，cAMP的濃度就會(huì)很高。第68頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4環(huán)腺苷酸化學(xué)式第69頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4

大腸桿菌中的代謝物激活蛋白，由Crp基因編碼，能與cAMP形成復(fù)合物。CRP和cAMP都是合成lacmRNA所必需的，cAMP-CRP是一個(gè)不同于阻遏物的正調(diào)控因子，而lac操縱子的功能是在這兩個(gè)相互獨(dú)立的調(diào)控體系作用下實(shí)現(xiàn)的。第70頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4gal，lac和ara操縱子上游啟動(dòng)子區(qū)與CRP-cAMP結(jié)合位點(diǎn)的相對(duì)位置分析第71頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4半乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖、山梨醇等在降解過(guò)程中均轉(zhuǎn)化成葡萄糖或糖酵解途徑中的其他中間產(chǎn)物，這些糖代謝中有關(guān)的酶都是由可誘導(dǎo)操縱子控制的，被稱為降解物敏感型操縱子(catabolitesensitiveoperon)，由cAMP-CRP調(diào)控。第72頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4大腸桿菌lac操縱子啟動(dòng)區(qū)CRP-cAMP及-35區(qū)，-10區(qū)序列分析。第73頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4cAMP-CRP復(fù)合物與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合是lacmRNA合成起始所必需的，因?yàn)檫@個(gè)復(fù)合物結(jié)合于啟動(dòng)子上游，能使DNA雙螺旋發(fā)生彎曲，有利于形成穩(wěn)定的開放型啟動(dòng)子-RNA聚合酶結(jié)構(gòu)。阻遏物則是一個(gè)抗解鏈蛋白，阻止形成開放結(jié)構(gòu)，從而抑制RNA聚合酶的功能。第74頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4CRP-cAMP與上游DNA位點(diǎn)結(jié)合后造成模板DNA沿對(duì)稱序列中央發(fā)生>90°的彎曲第75頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4附：葡萄糖水平CRP的關(guān)系

CRP只有與cAMP結(jié)合才有活性，而cAMP受葡萄糖水平的控制。葡萄糖含量高------cAMP水平低葡萄糖含量低------cAMP水平高第76頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/47.2.3lac操縱子的調(diào)控區(qū)域—P、O區(qū)P區(qū)（即啟動(dòng)子區(qū)）一般是從I基因結(jié)束到mRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游5-10bp，而O區(qū)（即阻遏物結(jié)合區(qū)）位于-7～+28位，該區(qū)的堿基序列有對(duì)稱性，其對(duì)稱軸在+11位堿基對(duì)。第77頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4不同操縱子啟動(dòng)區(qū)及O區(qū)相對(duì)位置的比較。第78頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/47.3色氨酸操縱子與負(fù)控阻遏系統(tǒng)色氨酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的組分，一般的環(huán)境難以給細(xì)菌提供足夠的色氨酸，細(xì)菌要生存繁殖通常需要自己經(jīng)過(guò)許多步驟合成色氨酸。一旦環(huán)境能夠提供色氨酸時(shí)，細(xì)菌就會(huì)充分利用外界的色氨酸、減少或停止合成色氨酸，以減輕自己的負(fù)擔(dān)。細(xì)菌所以能做到這點(diǎn)是因?yàn)橛猩彼岵倏v子(trpoperon)的調(diào)控。第79頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4大腸桿菌中trp操縱子第80頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/47.3.1色氨酸操縱子的結(jié)構(gòu)第81頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/47.3.2.阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控

合成色氨酸所需酶類的基因E、D、C、B、A等頭尾相接串連排列組成結(jié)構(gòu)基因群，受其上游的啟動(dòng)子Ptrp和操縱子O的調(diào)控，調(diào)控基因trpR的位置遠(yuǎn)離P-O-結(jié)構(gòu)基因群，在自身的啟動(dòng)子作用下，以組成性方式低水平表達(dá)分子量為47000的調(diào)控蛋白R(shí)，R并沒有與O結(jié)合的活性，當(dāng)環(huán)境能提供足夠濃度的色氨酸時(shí)，R與色氨酸結(jié)合后構(gòu)象變化而活化，就能夠與O特異性親和結(jié)合，阻遏結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。第82頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4

因此色氨酸操縱子屬于一種負(fù)性調(diào)控的、可阻遏的操縱子（repressibleoperon），即這操縱子通常是開放轉(zhuǎn)錄的，有效應(yīng)物（色氨酸為阻遏劑）作用時(shí)則阻遏關(guān)閉轉(zhuǎn)錄。細(xì)菌不少生物合成系統(tǒng)的操縱子都屬于這種類型，其調(diào)控可使細(xì)菌處在生存繁殖最經(jīng)濟(jì)最節(jié)省的狀態(tài)。

第83頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4當(dāng)缺乏色氨酸時(shí),該操縱子開放表達(dá)阻遏物當(dāng)存在色氨酸時(shí)，該操縱子關(guān)閉第84頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/47.3.3.弱化子及其作用

實(shí)驗(yàn)觀察表明：當(dāng)色氨酸達(dá)到一定濃度、但還沒有高到能夠活化R使其起阻遏作用的程度時(shí)，產(chǎn)生色氨酸合成酶類的量已經(jīng)明顯降低，而且產(chǎn)生的酶量與色氨酸濃度呈負(fù)相關(guān)。仔細(xì)研究發(fā)現(xiàn)這種調(diào)控現(xiàn)象與色氨酸操縱子特殊的結(jié)構(gòu)有關(guān)。第85頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4

在色氨酸操縱子PO與第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因trpE之間有162bp的一段前導(dǎo)區(qū)（leadingsequence，L），實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)色氨酸有一定濃度時(shí)，RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄會(huì)終止在這里。這段序列中含有編碼由14個(gè)氨基酸組成的短肽的開放閱讀框，其序列中有2個(gè)色氨酸相連，在此開放閱讀框前有核糖體識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)（RBS）序列，提示這段短開放閱讀框在轉(zhuǎn)錄后是能被翻譯的。第86頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4前導(dǎo)序列trpL(leadersequence):在trpmRNA5’端trpE基因的起始密碼前一個(gè)長(zhǎng)162bp的mRNA片段。起著隨色氨酸濃度升高降低轉(zhuǎn)錄的作用；弱化子(attenuator)：也稱內(nèi)部終止子，DNA中可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄過(guò)早終止的一段核甘酸序列（123-150bp）。弱化作用(attenuation)：弱化子控制RNA聚合酶通讀弱化子能力的調(diào)控機(jī)制。第87頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4弱化子第88頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4

mRNA前導(dǎo)區(qū)序列分析

trp前導(dǎo)區(qū)的堿基序列已經(jīng)全部測(cè)定，發(fā)現(xiàn)完整的前導(dǎo)序列可分為1、2、3、4區(qū)域，這四個(gè)區(qū)域的片段能以兩種不同的方式進(jìn)行堿基配對(duì)。第89頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4色氨酸操縱子的轉(zhuǎn)錄與翻譯調(diào)控第90頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4

有時(shí)以1-2和3-4配對(duì)，有時(shí)只以2-3方式互補(bǔ)配對(duì)。核糖體經(jīng)過(guò)前導(dǎo)區(qū)繼續(xù)翻譯的能力控制著這兩種結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)換，它決定mRNA是否形成終止所需的結(jié)構(gòu)。前導(dǎo)序列的終止區(qū)與一般的轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)特點(diǎn)相同，具有成串的U和潛在的能形成莖環(huán)的二重對(duì)稱結(jié)構(gòu)。第91頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4

通過(guò)RNaseT1降解實(shí)驗(yàn)（此酶不水解配對(duì)的RNA）表明純化的trp前導(dǎo)序列中只有1-2和3-4的配對(duì)方式。由此定位的3-4配對(duì)區(qū)正好位于終止密碼子識(shí)別區(qū)，當(dāng)這個(gè)區(qū)域發(fā)生破壞自我堿基突變，有利于轉(zhuǎn)錄的繼續(xù)進(jìn)行。第92頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4

轉(zhuǎn)錄的弱化理論認(rèn)為，mRNA轉(zhuǎn)錄的終止是通過(guò)前導(dǎo)肽基因的翻譯來(lái)調(diào)節(jié)的，在前導(dǎo)肽基因中有兩個(gè)相鄰的色氨酸密碼子，在翻譯時(shí)對(duì)tRNATrp的濃度十分敏感。當(dāng)培養(yǎng)基中色氨酸的濃度很低時(shí)，負(fù)載有色氨酸的tRNATrp也少，由此推斷，翻譯通過(guò)兩個(gè)相鄰色氨酸密碼子的速度就會(huì)很慢，當(dāng)4區(qū)被轉(zhuǎn)錄完成時(shí)，核糖體才進(jìn)行到1區(qū)（或停留在兩個(gè)相鄰的色氨酸密碼子處），第93頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4

這時(shí)的前導(dǎo)區(qū)結(jié)構(gòu)是2-3配對(duì)，不形成3-4配對(duì)的終止結(jié)構(gòu)，所以轉(zhuǎn)錄可繼續(xù)進(jìn)行，直到將色氨酸操縱子中的結(jié)構(gòu)基因全部轉(zhuǎn)錄完畢為止。測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在缺乏色氨酸時(shí)所有的RNA聚合酶都能經(jīng)過(guò)弱化子繼續(xù)參與轉(zhuǎn)錄。加上取消阻遏增加的約70倍的表達(dá)，總表達(dá)量可增加約700倍。第94頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4第95頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4色氨酸濃度低時(shí)1、tRNAtrp-色氨酸供給不足，核糖體遇到色氨酸密碼子時(shí)就停頓2、在4區(qū)轉(zhuǎn)錄未完成時(shí)，2區(qū)和3區(qū)就形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)3、3區(qū)和4區(qū)不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（終止信號(hào)），導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄通讀；RNA聚合酶繼續(xù)沿DNA移動(dòng)，完成結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄第96頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4

當(dāng)培養(yǎng)基中色氨酸濃度高時(shí)，核糖體可順利通過(guò)兩個(gè)相鄰的色氨酸密碼子，在4區(qū)被轉(zhuǎn)錄之前，核糖體就到達(dá)2區(qū)，這樣使2-3不能配對(duì)，3-4區(qū)可以自由配對(duì)形成莖-環(huán)式的終止子結(jié)構(gòu)，使得只有約10％的RNA聚合酶能繼續(xù)參與色氨酸操縱子結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。第97頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4色氨酸操縱子衰減作用機(jī)制第98頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4色氨酸濃度高時(shí)1、tRNAtrp-色氨酸供給充足，核糖體迅速通過(guò)色氨酸密碼子到達(dá)2區(qū)2、3區(qū)和4區(qū)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（終止信號(hào)）3、衰減作用發(fā)生，轉(zhuǎn)錄終止，RNA聚合酶釋放，不能完成結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄第99頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4

由此可見，弱化子對(duì)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的終止依賴于前導(dǎo)肽翻譯中核糖體所處的位置，而細(xì)胞中色氨酸存在與否，決定了mRNA轉(zhuǎn)錄的弱化子結(jié)構(gòu)，使弱化子中1、2、3、4區(qū)域呈現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)性配對(duì)，從而產(chǎn)生弱化效應(yīng)，這是色氨酸操縱子第二水平調(diào)控的機(jī)制。應(yīng)該指出，色氨酸含量變化對(duì)阻遏過(guò)程和弱化過(guò)程的作用方向是相同的。前者主要控制操縱子基因表達(dá)的啟動(dòng)，而后者主要決定轉(zhuǎn)錄和翻譯是否能繼續(xù)進(jìn)行下去。第100頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4弱化子作用第101頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4第102頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4第103頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4為什么需要阻遏體系？當(dāng)大量Trp存在時(shí)，阻遏系統(tǒng)起作用。阻抑蛋白與之結(jié)合，阻止先導(dǎo)mRNA合成。為什么需要弱化系統(tǒng)？當(dāng)trp濃度低時(shí)，阻抑蛋白從有活性變?yōu)闊o(wú)活性，速度極慢，不能很快引發(fā)trp合成。因此需要一個(gè)能快速作出反應(yīng)的系統(tǒng)，以保持培養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)腡rp水平。第104頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4

兩個(gè)調(diào)控系統(tǒng)，避免浪費(fèi)提高效率；阻遏系統(tǒng)高水平trp時(shí)，不轉(zhuǎn)錄低水平trp時(shí)，轉(zhuǎn)錄至前導(dǎo)序列弱化系統(tǒng)細(xì)調(diào)原核生物細(xì)致的精細(xì)調(diào)控機(jī)制，增強(qiáng)原核生物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性第105頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4衰減作用和負(fù)控阻遏的關(guān)系1、負(fù)控阻遏系統(tǒng)和衰減作用同樣對(duì)色氨酸水平應(yīng)答2、衰減作用使色氨酸操縱子結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄被抑制了10倍（細(xì)調(diào)）；3、色氨酸阻遏蛋白的阻遏作用使轉(zhuǎn)錄被抑制了70倍（粗調(diào)）；4、色氨酸水平對(duì)色氨酸操縱子結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)施加了700倍的調(diào)節(jié)效果。第106頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/47.4轉(zhuǎn)錄水平上的其他調(diào)控方式

轉(zhuǎn)錄過(guò)程涉及轉(zhuǎn)錄機(jī)器附著于DNA，識(shí)別啟動(dòng)子序列，起始RNA的合成，延伸和終止。轉(zhuǎn)錄的任何一步都受到調(diào)控，其中某些步驟是主要的調(diào)控點(diǎn)，比如RNA轉(zhuǎn)錄的起始相對(duì)延伸和終止來(lái)說(shuō)。自然選擇使得生物的調(diào)控策略達(dá)到最優(yōu)化。轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)節(jié)是生物基因表達(dá)調(diào)節(jié)最有效的方式。第107頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/47.4.1σ因子的調(diào)節(jié)作用

不同的σ因子可以獨(dú)立地起作用。但是，為了保證細(xì)胞準(zhǔn)確響應(yīng)不同的環(huán)境信號(hào)變化，σ因子之間常常交互作用構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)調(diào)控模式。使得原核基因的表達(dá)穩(wěn)定而平衡。σ因子本身的活性受到蛋白水解酶的調(diào)控，也能被同源的抗σ因了失活。這些抗σ因子能夠與特定的σ因子結(jié)合，阻止它們與RNA聚合酶的組裝。第108頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4σF的兩種存在形式第109頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/47.4.2轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的作用

能夠與基因的啟動(dòng)子區(qū)相結(jié)合，對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄起激活或抑制作用的DNA結(jié)合蛋白被稱為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。大腸桿菌基因組中有300多個(gè)基因編碼這樣的蛋白質(zhì)，它們大多數(shù)是序列特異性的DNA結(jié)合蛋白，能夠與特定的啟動(dòng)子結(jié)合。有些能夠調(diào)控大量基因的表達(dá)，而有些僅調(diào)控一兩個(gè)基因的表達(dá)。第110頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/47.4.3抗終止因子的調(diào)節(jié)作用

抗終止因子是能夠在特定位點(diǎn)阻止轉(zhuǎn)錄終止的一類蛋白質(zhì)。當(dāng)這些蛋白質(zhì)存在時(shí)，RNA聚合酶能夠越過(guò)終止子，繼續(xù)轉(zhuǎn)錄DNA。這種基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制主要見于噬菌體和少數(shù)細(xì)菌中。在RNA聚合酶到達(dá)終止子之前與RNA聚合酶結(jié)合、因?yàn)樵诮K止子上游存在抗終止作用的信號(hào)序列，只有與抗終止因子相結(jié)合的RNA聚合酶才能順利通過(guò)具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的終止子，使轉(zhuǎn)錄繼續(xù)進(jìn)行。第111頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4抗終止子通讀作用(a)開始轉(zhuǎn)錄

(b)缺少抗終止因子(c)存在抗終止因子第112頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4

參與大腸桿菌抗終止作用的蛋白是NusA蛋白。轉(zhuǎn)錄起始不久，σ因子從RNA聚合酶上解離下來(lái)，NusA蛋白就結(jié)合到了核心RNA聚合酶上。NusA的結(jié)合增加了RNA聚合酶在終止子發(fā)夾結(jié)構(gòu)處暫停的過(guò)程，從而促進(jìn)抗終止子作用的發(fā)生。第113頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4NusA和σ因子不能同時(shí)結(jié)合到RNA聚合酶上。只要RNA聚合酶結(jié)合在DNA上，NusA就不會(huì)從RNA聚合酶上解離，而σ因子可以取代游離RNA聚合酶上的NusA，因此，在轉(zhuǎn)錄起始和終止的過(guò)程中RNA聚合酶分別受到σ因子和NusA的調(diào)控。第114頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/47.5轉(zhuǎn)錄后調(diào)控7.5.1翻譯起始的調(diào)控遺傳信息的翻譯起始于mRNA上的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）----起始密子AUG上游的一段非翻譯區(qū)。在RBS中有SD序列，與核糖體16SrRNA的3’端互補(bǔ)配對(duì)，促使核糖體與mRNA相結(jié)合。RBS的結(jié)合強(qiáng)度取決于SD序列的結(jié)構(gòu)及與AUG之間的距離。SD與AUG之間相距一般以4～10核苷酸為佳，9核苷酸最佳。第115頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4………RBS第116頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4SDsequenceAUG~10basesUAAGGAGGU:complementarywith16srRNA5’第117頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4翻譯一個(gè)順反子需要二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，而這種二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變又依賴于前一個(gè)順反子的翻譯。mRNA上有多個(gè)核糖體存在時(shí)，第一個(gè)順反子的翻譯會(huì)破壞mRNA原有的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使核糖體能夠與下一個(gè)順反子的翻譯起始區(qū)域結(jié)合。7.5.2mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)翻譯起始的調(diào)控第118頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4第119頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/47.5.3調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控作用

細(xì)菌中有些mRNA結(jié)合蛋白可激活靶基因的翻譯。大腸桿菌BipA蛋白就其有依賴于核糖體的ATP酶活性，能夠激活轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋fismRNA的翻譯，是fis蛋白質(zhì)合成所必需的。第120頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4

相反，mRNA特異性抑制蛋白則通過(guò)與核糖體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合mRNA分子來(lái)抑制翻譯的起始。大腸桿菌中核糖體蛋白就存在翻譯抑制現(xiàn)象。rRNA基因正常的轉(zhuǎn)錄和翻譯將產(chǎn)生核糖體蛋白，由于這些蛋白與rRNA分子的親和力較強(qiáng)，只要細(xì)胞有足夠的rRNA分子，核糖體蛋白就不會(huì)結(jié)合到自身mRNA分子上。當(dāng)細(xì)胞中缺乏足夠的mRNA分子時(shí)，核糖體蛋白只能結(jié)合到自身mRNA分子上，導(dǎo)致該mRNA的RBS位點(diǎn)被封閉，蛋白質(zhì)合成停止。第121頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4核糖體蛋白對(duì)自身mRNA翻譯的抑制作用第122頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/47.5.4反義RNA的調(diào)節(jié)作用反義RNA是指與mRNA互補(bǔ)的RNA分子,也包括與其它RNA互補(bǔ)的RNA分子。由于核糖體不能翻譯雙鏈的RNA，所以反義RNA與mRNA特異性的互補(bǔ)結(jié)合,即抑制了該mRNA的翻譯。通過(guò)反義RNA控制mRNA的翻譯是原核生物基因表達(dá)調(diào)控的一種方式，最早是在E.coli的產(chǎn)腸桿菌素的ColE1質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)的,許多實(shí)驗(yàn)證明在真核生物中也存在反義RNA。

第123頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4

RNA調(diào)節(jié)是原核生物基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的另一種重要機(jī)制。細(xì)菌響應(yīng)環(huán)境壓力(氧化壓力、滲透壓、溫度等)的改變，會(huì)產(chǎn)生一些非編碼的小RNA分子，能與mRNA中的特定序列配對(duì)并改變所配對(duì)mRNA分子的構(gòu)象，導(dǎo)致翻澤過(guò)程被開啟或者關(guān)閉。也可能導(dǎo)致目標(biāo)mRNA分子的快速降解。第124頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/4反義RNA調(diào)控的可能機(jī)制1、和靶核苷酸序列形成雙鏈區(qū)，直接阻礙其翻譯的起始。2、在靶分子的部分區(qū)域形成雙鏈區(qū)，易成為內(nèi)切酶的底物，使與其結(jié)合的mRNA變得不穩(wěn)定3、反義RNA也可與轉(zhuǎn)錄物結(jié)合并裝扮成一個(gè)終止子，使轉(zhuǎn)錄提前結(jié)束第125頁(yè)，共140頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2023/4/47.5.5稀有密碼子對(duì)翻譯的影響實(shí)驗(yàn)證據(jù)RNA引物由dnaG基因編碼的引物酶催化合成dnaG、rpoD及rpsU屬于大腸桿菌基因組上的同一個(gè)操縱子。基因轉(zhuǎn)錄出來(lái)的三個(gè)蛋白相應(yīng)的mRNA拷貝數(shù)大體相同，由于翻譯的調(diào)控使得蛋白的拷貝數(shù)發(fā)生了很大的變化。第126頁(yè)，共140頁(yè)