基因工程第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)

基因工程第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)第1頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四常見的基因工程工具酶及其應(yīng)用1.使核酸降解的核酸酶類：2.催化核酸合成的酶類：

3.核酸修飾酶類；

核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶DNA連接酶、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA聚合酶甲基化酶、激酶、基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶、磷酸酶等第2頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四第3頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶第4頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四限制/修飾系統(tǒng)

(R-M,Restriction-modificationsystem)B和K分別代表大腸桿菌的B和K菌株（引自Streips等,2002）第5頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四一、寄主控制的限制與修飾機(jī)理

修飾(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通過甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修飾,從而免遭自身限制性酶的破壞。

第6頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四一、寄主控制的限制與修飾的機(jī)理限制(restriction)：指一定類型的細(xì)菌可以通過限制酶的作用，破壞入侵的噬菌體DNA，導(dǎo)致噬菌體的寄主幅度受到限制。維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。

第7頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四限制/修飾系統(tǒng)

(R-M，Restriction-modificationsystem)第8頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四各種細(xì)菌都能合成一種或幾種能夠切割雙鏈DNA的內(nèi)切核酸酶，以此來限制外源DNA的入侵幾乎所有的限制性內(nèi)切核酸酶都和能識(shí)別、甲基化相同DNA位點(diǎn)的甲基轉(zhuǎn)移酶（MTase）共同作用，一起構(gòu)成限制-修飾系統(tǒng)。

第9頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四

寄主控制的限制與修飾的作用:

一是保護(hù)自身的DNA不受限制；二是破壞外源DNA使之迅速降解。

基因工程中，應(yīng)采用

缺少限制作用的菌株作為受體。K12：

rk+mk+

rk-mk-（用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)）

rk-mk+（用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)）

rk+mk-（自殺型表型）第10頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四甲基化酶：甲基轉(zhuǎn)移酶①Dam甲基化酶

GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶

CCAGG或CCTGG第二個(gè)C上C5位置上引入甲基第11頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四

限制性內(nèi)切核酸酶：在細(xì)胞內(nèi)能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列，并對(duì)DNA分子進(jìn)行切割的一種酶以內(nèi)切方式水解雙鏈DNA中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5’端為磷酸基，3’端為羥基。1978年，W.Arber，H.O.Smith，Nathans因發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶及對(duì)其功能研究的突出貢獻(xiàn)獲得諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。第12頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四特性I型II型III型限制和修飾活性雙功能酶內(nèi)切核酸酶和甲基轉(zhuǎn)移酶分開雙功能酶酶蛋白分子組成3種不同亞基單一亞基兩種不同亞基限制作用所需輔助因子ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸Mg2+ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸特異性識(shí)別位點(diǎn)非對(duì)稱序列回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)非對(duì)稱序列切割位點(diǎn)在距識(shí)別位點(diǎn)至1kb處隨機(jī)切割識(shí)別位點(diǎn)上距識(shí)別位點(diǎn)24～26bp處序列特異性切割否是是甲基化作用的位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)識(shí)別未甲基化序列并切割能能能分子克隆中應(yīng)用無廣泛很少二、限制性內(nèi)切核酸酶的類型據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型三類?；蚬こ讨袕V泛使用第13頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四

普遍采用的是Smith和Nathans（1973）提議的命名系統(tǒng)由屬名的第一個(gè)字母（大寫）和種名的前兩個(gè)字母（小寫），組成3個(gè)字母的略語組成酶的基本名稱。例如，大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示，流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。三、限制性內(nèi)切核酸酶的命名第14頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四若該微生物有不同的變種或品系，再加上該變種或品系的第一個(gè)字母。如EcoRI，HindI；如果某一種寄主菌株，具有幾個(gè)不同的限制－修飾體系，則以羅馬數(shù)字表示。例如，流感嗜血菌Rd菌株的幾個(gè)限制與修飾體系分別表示為HindI、HindII、HindIII。注意所有字母、數(shù)字不再使用斜體，字母與羅馬數(shù)字之間不需要再留空格。所有的限制性酶，除了以上規(guī)定外，前面還應(yīng)帶有系統(tǒng)的名稱如限制性內(nèi)切核酸酶R.HindIII。同樣地，修飾酶則應(yīng)在它的系統(tǒng)名稱之前加上甲基轉(zhuǎn)移酶（M）名稱，如甲基轉(zhuǎn)移酶M.HindIII。在上下文已經(jīng)十分清楚且只涉及REase的情況下，R可被省去第15頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四EcoRIEscherichia屬名Coli種名Ry13株系編號(hào)

若種名頭2個(gè)字母相同則其中一個(gè)可用種名的第一和第三個(gè)字母。第16頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四Escherichiacoli

RI—Haemophilus

influensaedⅢ—Streptomyces

achromagenesI

（Ⅱ)—EcoRIHindⅢSacI(II)REBASE數(shù)據(jù)庫（http：///)：識(shí)別序列、甲基化敏感性、商業(yè)信息和參考文獻(xiàn)等，數(shù)據(jù)庫每日都在更新。第17頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四四、II型限制核酸內(nèi)切酶的基本特性II型限制性核酸內(nèi)切酶只有一種多肽，以同源二聚體的形式存在。由于其識(shí)別和切割DNA分子序列具有嚴(yán)格的特異性，因而是基因工程中廣泛使用的工具酶它們被譽(yù)為基因克隆的“分子剪刀”

(molecularscissors)。識(shí)別序列的特異性1切割位點(diǎn)的特異性2第18頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四（一）識(shí)別序列的特異性大多數(shù)II型限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列長(zhǎng)度為4～6bp，具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的回文序列如EcoRI的識(shí)別序列是：5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-3’第19頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四

稀有限制酶：

NotIGCGGCCGC

不嚴(yán)格專一限制酶：HindII-GTYRAC，

（Y表示C或T，R表示A或G）

識(shí)別序列越長(zhǎng)，位點(diǎn)出現(xiàn)的概率越?。海?/4）n

但實(shí)際上未必所有的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列的出現(xiàn)概率都符合這樣的規(guī)律。第20頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四

具有6堿基識(shí)別序列的不同REase產(chǎn)生的片段，其平均大小可能與預(yù)計(jì)值4096bp會(huì)有很大差異（表2-4）第21頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四（二）切割位點(diǎn)的特異性

1.DNA分子酶切片段的末端依所用REase的不同，酶切后產(chǎn)生的片段末端，有黏性末端和平末端等形式。第22頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四（1）黏性末端（stickyend）黏性末端是指DNA分子在REase的作用下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸形成的末端結(jié)構(gòu)，它們能夠通過互補(bǔ)堿基間的配對(duì)而重新連接起來。

圖2-2EcoRI產(chǎn)生的黏性末端及與其他來源互補(bǔ)黏性末端的退火連接

第23頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四

限制性內(nèi)切核酸酶在識(shí)別序列的雙側(cè)進(jìn)行切割，會(huì)產(chǎn)生兩種形式的黏性末端：①若于對(duì)稱軸的5‘末端切割，可產(chǎn)生5’端突出的黏性末端，如EcoRI；②若于對(duì)稱軸的3‘端切割，則產(chǎn)生3’端突出的黏性末端，如PstI（圖2-3）。

5’黏性末端3’黏性末端第24頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四（2）平末端（bluntend）。若REase限制性酶在識(shí)別序列的對(duì)稱軸上切割，形成的片斷末端為平末端，如SmaI（圖2-3）。平末端第25頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四5’突出的黏性末端第26頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四3’突出的黏性末端第27頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四

平頭末端第28頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四黏性末端的意義①連接便利

i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。這比連接兩個(gè)平齊末端容易的多。第29頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四ii）同一個(gè)DNA分子內(nèi)連接：通過兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。

第30頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四②5’末端標(biāo)記凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶進(jìn)行32P標(biāo)記凸出的3’端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個(gè)多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。

③補(bǔ)平成平齊末端粘性末端可以用DNA聚合酶補(bǔ)平成平齊末端。第31頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四2.同裂酶與同尾酶：SstICCGCGGSacICCGCGG新裂酶

KpnIGGTACCAsp718GGTACC

可應(yīng)用有些同裂酶對(duì)甲基化位點(diǎn)的敏感性不同，進(jìn)行同樣的切割，但可能產(chǎn)生不同的末端。

同裂酶:能識(shí)別相同序列但來源不同的兩種或多種限制酶KpnIGGTACCAsp718GGTACC第32頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四

Sau3AIBamHIGATC GGATCCCTAG CCTAGGSauI XhoI

GTCGAC CTCGAG

CAGCTG GAGCTCTCGA

?AGCTCGGC同尾酶（isocaudamer）：來源各異，識(shí)別的靶序列也各不相同，但切割后能產(chǎn)生相同的黏性末端，稱為同尾酶。第33頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四利用同尾酶可使切割位點(diǎn)的選擇余地更大(相容性末端);同時(shí)，同尾酶產(chǎn)生的DNA片段能通過粘性末端之間的互補(bǔ)作用而彼此連接起來，這在分子克隆中有一定的作用;雜種位點(diǎn)（hybridsite）：由一對(duì)同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價(jià)結(jié)合形成的位點(diǎn)。一般不能被原來的任何一種同尾酶識(shí)別。同尾酶可便于克隆載體的改造和構(gòu)建，且可用于消除某些限制酶切點(diǎn)，但如果要回收重組克隆中的插入片段時(shí)，則要慎重選擇適當(dāng)?shù)耐裁?。?4頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四

五、影響限制性內(nèi)切核酸酶活性的因素DNA分子的構(gòu)型酶的星號(hào)活性反應(yīng)緩沖液DNA樣品的純度2酶切反應(yīng)的溫度4酶的純度31DNA的甲基化程度335736第35頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四（一）酶的純度高質(zhì)量的限制性內(nèi)切核酸酶應(yīng)是通過全面提純的，不存在其他內(nèi)切核酸酶或外切酶的污染在長(zhǎng)時(shí)間酶解時(shí)不出現(xiàn)識(shí)別序列特異性的下降酶解的DNA片段連接后能重新被識(shí)別和切割等。

第36頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四（二）DNA樣品的純度在采用不同的方法制備DNA樣品過程中，會(huì)使樣品含有殘留氯仿、苯酚、乙醇、EDTA、SDS、鹽離子等物質(zhì)，或未去除干凈的蛋白質(zhì)或多糖的殘留物，這些物質(zhì)都可能影響REase的酶切反應(yīng)活性。第37頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四條件受到限制，且必須在DNA純度不高的情況下進(jìn)行切割，可考慮采取以下措施提高酶活性適當(dāng)增加酶的用量擴(kuò)大反應(yīng)體系體積延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間添加陽離子亞精胺第38頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四（三）DNA的甲基化程度原核生物細(xì)胞內(nèi)存在限制-修飾系統(tǒng)，其中MTase甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì)DNA起修飾作用，從而使自身DNA不受體內(nèi)限制性內(nèi)切核酸酶的切割甲基化作用直接影響限制性內(nèi)切核酸酶的活性為了克服MTase甲基轉(zhuǎn)移酶的影響，在基因克隆中使用MTase缺失的菌株來制備質(zhì)粒DNA。第39頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四（四）酶切反應(yīng)的溫度消化DNA分子時(shí)，不同的REase具有不同的最適反應(yīng)溫度。對(duì)于大多數(shù)限制性內(nèi)切核酸酶，最適反應(yīng)溫度為37℃，但也有例外。例如，SmaI、ApaI、BclI、MaeIII、TaqI的最適反應(yīng)溫度分別是25℃、30℃、50℃、是55℃、65℃。酶切反應(yīng)時(shí)低于或高于最適溫度，都會(huì)影響酶的活性，甚至使酶失活。第40頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四（五）DNA分子的構(gòu)型底物DNA分子的構(gòu)型會(huì)對(duì)限制性內(nèi)切核酸酶的活性產(chǎn)生明顯影響。例如，對(duì)超螺旋質(zhì)粒DNA或病毒DNA分子酶切時(shí)，所需要的酶量比對(duì)線性DNA分子酶切時(shí)所需要的酶量要高許多。第41頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四超螺旋質(zhì)粒DNA分子線性DNA分子第42頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四

（六）反應(yīng)緩沖液限制性內(nèi)切核酸酶的反應(yīng)緩沖液中包含有以下幾種成分：氯化鎂或醋酸鎂、氯化鈉或醋酸鉀、二硫蘇糖醇（DTT）或β-巰基乙醇、Tris·HCl或Tris·HAc。多數(shù)酶切反應(yīng)所需pH7.0～7.6。緩沖液中β-巰基乙醇或DTT可防止酶的氧化。市售酶中都配有10倍的濃縮緩沖液，使用時(shí)只需加反應(yīng)體系的1/10即可。

第43頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四（七）酶的星號(hào)活性（staractivity）定義：限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別和切割特異性位點(diǎn)是在特定的條件下測(cè)定的。當(dāng)條件改變時(shí)，許多酶的識(shí)別位點(diǎn)會(huì)改變，導(dǎo)致識(shí)別與切割序列的非特異性，這種現(xiàn)象稱為星號(hào)活性。導(dǎo)致星號(hào)活性的原因主要有：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值等第44頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四六、限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA的不同消化作用的應(yīng)用DNA分子的雙酶切消化

1DNA分子的完全酶切消化和部分酶切消化2第45頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四（一）DNA分子的雙酶切消化定義：在分子克隆實(shí)驗(yàn)中，有時(shí)需要雙酶切法，即用兩種不同的REase切割同一種DNA分子，從而產(chǎn)生DNA分子片段帶有兩個(gè)不同的末端。如果載體分子也用同樣的兩種酶切，這樣就可以把外源DNA酶切片段定向地插入到載體分子中。第46頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四（二）DNA分子的完全酶切消化和部分酶切消化完全酶切消化：內(nèi)切酶在DNA上的所有識(shí)別位點(diǎn)都被切開。部分酶切消化：內(nèi)切酶在DNA上的所有位點(diǎn)只有部分被切開。在實(shí)驗(yàn)中，通常通過縮短酶切消化的反應(yīng)時(shí)間或降低反應(yīng)溫度以約束酶的活性以達(dá)到部分消化的目的。第47頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四DNA分子的完全酶切消化（a）和部分酶切消化（b）第48頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四七、限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用：重組前DNA的切割構(gòu)建新載體構(gòu)建物理圖譜第49頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四

第二節(jié)DNA連接酶第50頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四

第二節(jié)DNA連接酶剪刀-限制性內(nèi)切酶針線、膠水-連接酶第51頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四概念：DNA連接酶是1967年在三個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)發(fā)現(xiàn)的。它是一種能夠催化雙鏈DNA上彼此相鄰的3’-羥基（OH）和5’-磷酸基團(tuán)（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯鍵。該過程為吸能反應(yīng)過程。連接反應(yīng)的特點(diǎn)：①一條DNA鏈的3’末端具有游離的羥基（-OH），而另一條DNA鏈的5’末端具有游離的磷酸基團(tuán)（-P）；②連接需要ATP或NAD+和Mg2+為輔助因子和激活因子；③被連接的DNA鏈必須是雙螺旋的一部分；④DNA連接酶只封閉雙螺旋DNA骨架上的缺口(nick)。一、DNA連接酶（DNAligase）

第二節(jié)DNA連接酶第52頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四

DNA連接酶對(duì)不同DNA分子的連接作用第53頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四DNA連接酶只封閉雙螺旋DNA骨架上的缺口(nick)缺口（nick）：雙鏈DNA的某一條鏈上兩個(gè)相鄰核苷酸之間失去一個(gè)磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈斷裂。裂口（gap）：雙鏈DNA的某一條鏈上失去一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸所形成的單鏈斷裂。第54頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四第55頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四類型：T4噬菌體DNA連接酶、大腸桿菌DNA連接酶和熱穩(wěn)定DNA連接酶。大腸桿菌和其他細(xì)菌的DNA連接酶以NAD+作為能量來源，動(dòng)物細(xì)胞和噬菌體的連接酶則以ATP作為能量來源第56頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四（一）T4噬菌體DNA連接酶（應(yīng)用最廣泛的連接酶）T4DNA連接酶可連接DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA和雙鏈DNA粘性末端或平末端的連接，是基因工程中廣泛使用的連接酶高濃度（＞100mmol／L）單價(jià)陽離子，如Na+和K+，可對(duì)T4DNA連接酶的活性產(chǎn)生抑制。而聚合劑可增強(qiáng)連接酶活性。（二）大腸桿菌DNA連接酶連接具粘性末端DNA分子，對(duì)平末端及DNA-RNA之間的連接效率低下，在分子克隆實(shí)驗(yàn)中不常用。（三）熱穩(wěn)定DNA連接酶優(yōu)先作用于雙鏈的缺口，可在多次的熱循環(huán)后依然保持活性，因此被廣泛用于檢測(cè)哺乳類DNA突變的擴(kuò)增反應(yīng)中。

二、DNA連接酶的特性第57頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四

連接酶底物輔助因子和激活因子溫度巰基試劑黏性末端平末端DNA-RNA雜合體RNA-RNA雜合體E.coliDNA連接酶可行可行不行不行NAD+

Mg2+（1～3mmol/L）黏性末端:10～15℃補(bǔ)平缺口：37℃不需要T4DNA連接酶可行可行可行可行ATPMg2+（10mmol/L）黏性末端：4℃平末端：10～25℃補(bǔ)平缺口：37℃需DTT噬熱菌連接酶可行不行不行不行NAD+

Mg2+（10mmol/L）黏性末端：24～37℃補(bǔ)平缺口：65～72℃需要表2-5DNA連接酶的部分性質(zhì)第58頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四三、DNA連接酶的連接機(jī)理

DNA連接酶是利用ATP

或NAD+提供的能量催化

DNA雙鏈間的缺口形成磷酸二酯鍵，連接反應(yīng)的機(jī)理已被詳細(xì)研究（圖2-5）。

圖2-5T4DNA連接酶作用機(jī)理第59頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四四、影響連接反應(yīng)的因素10×T4DNALigaseBuffer 1μlpKRX-T（30ng/μl）1μl已純化的PCR產(chǎn)物 Xμl*T4DNALigase2~3WeissUnitsddH2O 至10μlDNA連接酶的反應(yīng)體系16℃連接過夜第60頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四在進(jìn)行DNA分子重組操作中，有許多因素會(huì)影響到DNA片段的連接，包括：連接反應(yīng)的溫度連接酶濃度反應(yīng)時(shí)間DNA的末端結(jié)構(gòu)及不同DNA片段末端的相對(duì)濃度ATP濃度離子濃度等

第61頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四1.反應(yīng)溫度溫度是影響連接反應(yīng)連接效率的主要因素。連接酶的最佳反應(yīng)溫度是37℃，但是在這個(gè)溫度下，黏性末端之間退火形成的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。與黏性末端的連接反應(yīng)相比，平末端連接反應(yīng)受溫度的影響較小。第62頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四2.連接酶濃度在同樣的條件下，具黏性末端DNA片段間的連接比平末端DNA分子的連接所需酶濃度低。3.ATP濃度

T4噬菌體DNA連接酶需要ATP作為連接反應(yīng)的輔助因子，其濃度對(duì)酶的影響很大。其反應(yīng)終濃度變化范圍在10μmol～1mmol/L之間，一般情況下ATP最適的終濃度為0.5mmol/L。第63頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四4.DNA片段末端由于連接反應(yīng)涉及不同DNA分子（分子間連接），因此連接反應(yīng)對(duì)DNA分子的末端濃度會(huì)十分敏感。在反應(yīng)體系中，有載體分子和要插入載體的DNA片段，由于DNA末端之間的相互競(jìng)爭(zhēng)，可形成不同構(gòu)型的DNA分子（圖2-6），所以不僅要考慮反應(yīng)體系中DNA末端的總濃度，而且還要考慮載體與插入片段的末端濃度的比例。第64頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四圖2-6分子間的不同連接產(chǎn)物

第65頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四回顧上節(jié)課內(nèi)容1、限制-修飾系統(tǒng)：缺陷型工程菌的選擇2、II型限制酶的基本特性:3、平末端與粘性末端：4、同尾酶與同切點(diǎn)酶:5、應(yīng)用：?jiǎn)蚊盖信c雙酶切；完全消化與不完全消化6、T4連接酶的連接特點(diǎn)第66頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四第三節(jié)DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶第67頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四第三節(jié)DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶第68頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四

第三節(jié)DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶（DNApolymerase)指能在引物和模板的存在下，將脫氧核糖單核苷酸連續(xù)地加到雙鏈DNA分子引物鏈的3‘-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。類型：①依賴于DNA的DNA聚合酶，如耐熱的TaqDNA聚合酶；②依賴于RNA的DNA聚合酶——反轉(zhuǎn)錄酶。第69頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四

表2-6DNA聚合酶的部分性質(zhì)DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿菌DNA聚合酶I低有中低Klenow片段低無中低T4DNA聚合酶高無中低T7DNA聚合酶高無快高化學(xué)修飾T7DNA聚合酶低無快高遺傳修飾T7DNA聚合酶無無快高反轉(zhuǎn)錄酶無無低中TaqDNA聚合酶無有快高第70頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四（一）大腸桿菌DNA聚合酶I

從大腸桿菌中分離純化得到3種類型的DNA聚合酶，DNApolI、DNApolyII、DNApolyIII，其中DNApolyI在分子克隆中最為常用。

DNApolyI具有3種活性：①5‘→3’DNA聚合酶活性；②3‘→5’外切酶活性；③5’→3’外切酶活性（圖2-7）。也稱為DNA聚合酶I全酶。一、DNA聚合酶第71頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四A.5'→3'聚合酶活性；B.5'→3'外切酶活性；C.3'→5'外切酶活性圖2-7大腸桿菌DNA聚合酶I活性

第72頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四

用途：

1）除去3’-端突起的單鏈DNA（在無dNTP時(shí)）

2）補(bǔ)齊5’-突起端

3）合成第二條cDNA4）切口移位制備探針

其中用途2)和3)常用Klenow大片段第73頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四切口平移（nicktranslation）制備探針：第74頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四（二）Klenow片段

大腸桿菌DNApoll經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理,獲得N端三分之二的大肽段,即Klenow片段。

Klenow片段仍擁有5`→3`的DNA聚合酶活性和3`→5`的核酸外切酶活性，但失去了5`→3`的核酸外切酶活性。第75頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四分子克隆中Klenow片段的主要用途有：①補(bǔ)平經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶消化DNA所形成的3’凹陷末端，包括帶裂口的雙鏈DNA的修復(fù)；5’

klenowklenow5’

②用32PdNTP對(duì)帶3'凹陷末端補(bǔ)平，標(biāo)記DNA分子3'末端；第76頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四③在cDNA克隆中，用于cDNA第二鏈的合成；mRNA5’5’5’3’3’3’逆轉(zhuǎn)錄klenow引物cDNA第一鏈cDNA第二鏈第77頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四④用于Sanger雙脫氧末端終止法進(jìn)行DNA序列分析；⑤在單鏈模板上延伸寡核苷酸引物，以合成雜交探針和進(jìn)行體外突變。第78頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四（三）T4噬菌體DNA聚合酶

T4噬菌體DNA聚合酶來源于T4噬菌體感染的大腸桿菌，相對(duì)分子質(zhì)量為114000，由單一肽鏈組成。與Klenow片段相似，T4噬菌體DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性，缺少5'→3'外切酶活性。但其3'→5'外切酶活性比Klenow片段要高200倍。第79頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四T4噬菌體DNA聚合酶的主要作用有：①用于補(bǔ)平或標(biāo)記DNA分子經(jīng)REase消化后產(chǎn)生的3‘凹端；②對(duì)帶有3‘突出末端或平末端的DNA片段進(jìn)行標(biāo)記，制備特異性探針；③利用T4噬菌體DNA聚合酶強(qiáng)的3'→5'外切酶活性，將雙鏈DNA的末端轉(zhuǎn)化為平末端。第80頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四第81頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四（四）T7噬菌體DNA聚合酶

T7噬菌體DNA聚合酶是所有已知DNA聚合酶中持續(xù)結(jié)合能力最強(qiáng)的一個(gè)，所催化合成的DNA平均長(zhǎng)度要比其他DNA聚合酶催化合成的DNA平均長(zhǎng)度大得多，在分子克隆實(shí)驗(yàn)中主要用于催化大分子模板。

T7噬菌體DNA聚合酶具有很強(qiáng)的3‘→5’外切酶活性，其外切活性約為大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段的1000倍。在分子克隆中，第82頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四（五）TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶具有耐高溫的特性，Saiki等于1988年將該酶成功地用于PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)），從而極大地促進(jìn)了DNA的離體擴(kuò)增技術(shù)的飛速發(fā)展。TaqDNA聚合酶除具有5‘→3’聚合酶活性外，還有5‘→3’外切酶活性，但沒有3‘→5’外切活性，因而無3‘→5’方向的校正功能。普通TaqDNA聚合酶在聚合鏈末端不依賴模板多聚合出一個(gè)腺苷酸，人們根據(jù)這種性質(zhì)，設(shè)計(jì)出了一種線型克隆載體—T載體，其5'末端有一個(gè)突出的T，正好與PCR產(chǎn)物3'端突出的A互補(bǔ)，這樣就可方便地將PCR產(chǎn)物直接連接到載體上。

第83頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四是以RNA為模板，催化合成互補(bǔ)的DNA（complementaryDNA，cDNA）單鏈。普遍存在于含RNA的反轉(zhuǎn)錄病毒中。目前市售的反轉(zhuǎn)錄酶主要有2個(gè)來源：作用①禽源的，來源于禽類成髓細(xì)胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus，AMV），42℃；②鼠源的，來源于Moloney鼠白血病病毒（Moloneymurineleukemiavirus，Mo-MLV），37℃。二、反轉(zhuǎn)錄酶第84頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四在分子克隆中反轉(zhuǎn)錄酶主要作用于：①以mRNA為模板合成其互補(bǔ)DNA（cDNA），用于構(gòu)建cDNA文庫和基因克??；②對(duì)具5’端突出的DNA片段的3’進(jìn)行補(bǔ)平和標(biāo)記，制備雜交探針；③代替大腸桿菌DNApolI、Klenow片段或測(cè)序酶，用于DNA序列分析。第85頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四④RNA酶H活性：對(duì)RNA:DNA雜交體中的RNA特異性地降解，免除了在反轉(zhuǎn)錄完成后再用NaOH降解RNA模板。RNaseH活性第86頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四第四節(jié)DNA修飾酶第87頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四簡(jiǎn)稱末端轉(zhuǎn)移酶，可以在無模板的條件下，非特異地將脫氧核苷酸添加到DNA分子的3’-OH末端，伴隨無機(jī)磷酸的釋放。末端轉(zhuǎn)移酶主要用途有：1）按照模板合成多聚核糖核苷同聚物(同聚物加尾);2）用于克隆DNA片段到目的載體中;3）用于DNA片段3’末端標(biāo)記。一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶與同聚物加尾第88頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四末端轉(zhuǎn)移酶同聚物加尾功能圖解第89頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四T4多核苷酸激酶催化ATP的γ-磷酸基轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5’-OH末端，使已脫磷酸化的5’末端重新磷酸化。這種作用不受底物分子鏈的長(zhǎng)短的限制，即使單核苷酸也同樣適用。該酶常用于兩種反應(yīng)：正向反應(yīng)和交換反應(yīng)。（1）正向反應(yīng)：即催化5‘-OH末端的磷酸化，這是T4多核苷酸激酶的最主要功能。（2）交換反應(yīng)：當(dāng)過量ADP存在時(shí)，DNA分子的5‘磷酸轉(zhuǎn)移給ADP，然后脫磷酸化的DNA分子再從帶有γ-32P的ATP中獲得γ-32P基團(tuán)，重新磷酸化DNA分子就獲得了32P同位素標(biāo)記。二、T4多核苷酸激酶與DNA5’端磷酸化第90頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四

圖2-9T4多核苷酸激酶的正向反應(yīng)活性（A）和交換反應(yīng)活性（B）﹡代表放射性同位素標(biāo)記第91頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四堿性磷酸酶能夠催化核酸分子脫掉5‘的磷酸基團(tuán)，從而使DNA（或RNA）片段的5’－P末端轉(zhuǎn)換成5‘－OH末端。堿性磷酸酶有兩種來源：一種來源于大腸桿菌，叫做細(xì)菌堿性磷酸酶（bacterialalkalinephosphatase，BAP）；另一種來源于小牛腸，叫做小牛腸堿性磷酸酶（calfintestinalalkalinephosphatase，CIP）。三、堿性磷酸酶與DNA5’端去磷酸化第92頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四堿性磷酸酶在基因工程中的用途主要有以下兩個(gè)方面：（1）DNA分子片段5‘末端的去磷酸化，防止自身連接。（2）在5‘末端標(biāo)記之前，去除DNA或RNA分子的5’末端磷酸基團(tuán)。第93頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四

圖2-10載體分子的去磷酸化與外源DNA的連接（引自Weaver，2002）其中每條鏈上都有一個(gè)nick，但轉(zhuǎn)入細(xì)菌后會(huì)被修復(fù)。第94頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四第五節(jié)外切核酸酶（自學(xué)）核酸外切酶是一類從多核苷酸鏈的一頭開始催化降解核苷酸的酶。作用于單鏈的核酸外切酶

如：大腸桿菌核酸外切酶I（exoI）；大腸桿菌核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）作用于雙鏈的核酸外切酶

如：大腸桿菌核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）；噬菌體核酸外切酶（

exo）；T7噬菌體基因6核酸外切酶既可作用于單鏈又可作用于雙鏈的核酸外切酶

如：Bal31核酸酶第95頁，共108頁，2023年，2月20日，星期四

第六節(jié)單鏈核酸內(nèi)切酶Bal31核酸酶S1核酸酶脫氧核糖核