口腔細(xì)菌的培養(yǎng)及應(yīng)用

第一節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)一、細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理現(xiàn)在是1頁\一共有149頁\編輯于星期三細(xì)胞培養(yǎng)：模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在適當(dāng)?shù)臈l件下，使活體組織細(xì)胞在體外環(huán)境存活、生長增殖，并維持其結(jié)構(gòu)功能?，F(xiàn)在是2頁\一共有149頁\編輯于星期三培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)現(xiàn)在是3頁\一共有149頁\編輯于星期三

貼壁型細(xì)胞：必須貼附于支持物表面才能生長。大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細(xì)胞現(xiàn)在是4頁\一共有149頁\編輯于星期三按照培養(yǎng)細(xì)胞的主要形態(tài)，可分為幾大類型現(xiàn)在是5頁\一共有149頁\編輯于星期三

成纖維細(xì)胞型胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時呈放射狀、火焰狀、漩渦狀。除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌細(xì)胞等等常呈本型狀態(tài)。另外，凡培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細(xì)胞。現(xiàn)在是6頁\一共有149頁\編輯于星期三現(xiàn)在是7頁\一共有149頁\編輯于星期三現(xiàn)在是8頁\一共有149頁\編輯于星期三

上皮型細(xì)胞細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜，生長時呈膜狀移動，起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)?，F(xiàn)在是9頁\一共有149頁\編輯于星期三現(xiàn)在是10頁\一共有149頁\編輯于星期三現(xiàn)在是11頁\一共有149頁\編輯于星期三現(xiàn)在是12頁\一共有149頁\編輯于星期三游走細(xì)胞型在支持物上呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。多型細(xì)胞型有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類?，F(xiàn)在是13頁\一共有149頁\編輯于星期三現(xiàn)在是14頁\一共有149頁\編輯于星期三懸浮型細(xì)胞：于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面，見于某些癌細(xì)胞和血液淋巴細(xì)胞現(xiàn)在是15頁\一共有149頁\編輯于星期三培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長

或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長

來自血，脾或骨髓在懸浮中生長良好細(xì)胞圓形，單個或小細(xì)胞團(tuán)生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)，易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)觀察不方便現(xiàn)在是16頁\一共有149頁\編輯于星期三現(xiàn)在是17頁\一共有149頁\編輯于星期三培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程

現(xiàn)在是18頁\一共有149頁\編輯于星期三

培養(yǎng)細(xì)胞生命期

所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間?，F(xiàn)在是19頁\一共有149頁\編輯于星期三現(xiàn)在是20頁\一共有149頁\編輯于星期三原代培養(yǎng)期：

也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性大。細(xì)胞群是異質(zhì)的，也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)。細(xì)胞獨(dú)立生存性差。初代培養(yǎng)細(xì)胞多呈二倍體核型；由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞性狀相似性大，是檢測藥物很好的實(shí)驗(yàn)對象?，F(xiàn)在是21頁\一共有149頁\編輯于星期三傳代期：

初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系。在全生命期中此期的持續(xù)時間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。反復(fù)傳代就有可能導(dǎo)致細(xì)胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期?，F(xiàn)在是22頁\一共有149頁\編輯于星期三衰退期：

此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點(diǎn)（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性或惡性性。細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系，也稱連續(xù)細(xì)胞系。無限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。細(xì)胞永生性和惡性性非同一性狀?，F(xiàn)在是23頁\一共有149頁\編輯于星期三

培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期

所謂細(xì)胞“一代”一詞，系僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第n代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代n次。在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增3～6次。細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個階段：現(xiàn)在是24頁\一共有149頁\編輯于星期三潛伏期（游離期，貼壁期）對數(shù)生長期停止期（平臺期）現(xiàn)在是25頁\一共有149頁\編輯于星期三潛伏期：

細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結(jié)束。各種細(xì)胞貼附速度不同，這與細(xì)胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。現(xiàn)在是26頁\一共有149頁\編輯于星期三初代培養(yǎng)細(xì)胞貼附慢，可長達(dá)10～24小時或更多；連續(xù)細(xì)胞系和惡性細(xì)胞系快，10～30分鐘即可貼附。細(xì)胞貼附現(xiàn)象是一個非常復(fù)雜和與多種因素相關(guān)的過程。支持物能影響細(xì)胞的貼附；底物表面不潔不利貼附，底物表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中，有一些特殊物質(zhì)如纖維連接素，細(xì)胞表面蛋白等也參與貼附過程。這些物質(zhì)都是蛋白類成分，它們有的存在于細(xì)胞膜的表面，有的則來自培養(yǎng)基中的血清。貼附是貼附類細(xì)胞生長增殖條件之一。

現(xiàn)在是27頁\一共有149頁\編輯于星期三初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長，約24～96小時或更長，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅6～24小時；細(xì)胞接種密度大時潛伏期短。當(dāng)細(xì)胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入指數(shù)增生期。

現(xiàn)在是28頁\一共有149頁\編輯于星期三現(xiàn)在是29頁\一共有149頁\編輯于星期三現(xiàn)在是30頁\一共有149頁\編輯于星期三指數(shù)增生期：

這是細(xì)胞增值最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長旺盛與否的一個重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂指數(shù)表示，即細(xì)胞群中每1000個細(xì)胞中的分裂相數(shù)。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%～0.5%，初代細(xì)胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%～5%?，F(xiàn)在是31頁\一共有149頁\編輯于星期三特點(diǎn)：是細(xì)胞增生最活躍、活力最旺盛的階段培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增長,細(xì)胞群體均一是理想的實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞

現(xiàn)在是32頁\一共有149頁\編輯于星期三

在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3～5天后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長空間漸趨減少、最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。細(xì)胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞，由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運(yùn)動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制。

現(xiàn)在是33頁\一共有149頁\編輯于星期三細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。現(xiàn)在是34頁\一共有149頁\編輯于星期三停滯期：

細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平臺期。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。現(xiàn)在是35頁\一共有149頁\編輯于星期三現(xiàn)在是36頁\一共有149頁\編輯于星期三培養(yǎng)細(xì)胞的體外生長環(huán)境現(xiàn)在是37頁\一共有149頁\編輯于星期三無污染環(huán)境現(xiàn)在是38頁\一共有149頁\編輯于星期三超凈臺超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。

現(xiàn)在是39頁\一共有149頁\編輯于星期三濾器現(xiàn)在是40頁\一共有149頁\編輯于星期三壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣電熱干燥箱：干熱消毒（160℃，2小時）。主要用干玻璃器皿消毒濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌超凈工作臺：為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境紫外燈：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒

現(xiàn)在是41頁\一共有149頁\編輯于星期三基質(zhì)玻璃基質(zhì)塑料飼養(yǎng)細(xì)胞生物性基質(zhì)處理培養(yǎng)表面金屬現(xiàn)在是42頁\一共有149頁\編輯于星期三現(xiàn)在是43頁\一共有149頁\編輯于星期三氣體環(huán)境和氫離子濃度Hepers緩沖液CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-CO2:5%現(xiàn)在是44頁\一共有149頁\編輯于星期三液相環(huán)境現(xiàn)在是45頁\一共有149頁\編輯于星期三水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液

現(xiàn)在是46頁\一共有149頁\編輯于星期三天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來源受限。成分復(fù)雜，影響對某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染現(xiàn)在是47頁\一共有149頁\編輯于星期三合成培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。成本低缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要?，F(xiàn)在是48頁\一共有149頁\編輯于星期三人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。

現(xiàn)在是49頁\一共有149頁\編輯于星期三血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子；③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分現(xiàn)在是50頁\一共有149頁\編輯于星期三無血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充各種必需因子，如激素、生長因子、結(jié)合蛋白、貼壁和擴(kuò)展因子等。無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充成分組成。無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，，減少了細(xì)胞污染，簡化了提純和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序?，F(xiàn)在是51頁\一共有149頁\編輯于星期三溫度滲透壓現(xiàn)在是52頁\一共有149頁\編輯于星期三二、細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法現(xiàn)在是53頁\一共有149頁\編輯于星期三無菌操作技術(shù)

現(xiàn)在是54頁\一共有149頁\編輯于星期三體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。即便使用設(shè)備完善的實(shí)驗(yàn)室，若實(shí)驗(yàn)者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范,也會導(dǎo)致污染。因而,為在一切操作中最大可能地保證無菌，每一項(xiàng)工作都必須做到有條不紊和完全可靠?，F(xiàn)在是55頁\一共有149頁\編輯于星期三培養(yǎng)前準(zhǔn)備在開始實(shí)驗(yàn)前要制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺)內(nèi)消毒。這可以避免開始實(shí)驗(yàn)后，因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會。

現(xiàn)在是56頁\一共有149頁\編輯于星期三培養(yǎng)室的消毒無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實(shí)驗(yàn)前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。—些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒。

現(xiàn)在是57頁\一共有149頁\編輯于星期三洗手和著裝原則上和外科手術(shù)相同。并于開始操作前要用75％酒精消毒手和前臂。如果實(shí)驗(yàn)過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽?，F(xiàn)在是58頁\一共有149頁\編輯于星期三培養(yǎng)過程中的無菌操作在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌工作時，首先要點(diǎn)燃酒精燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。進(jìn)行培養(yǎng)時，動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機(jī)會。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。

現(xiàn)在是59頁\一共有149頁\編輯于星期三基本培養(yǎng)操作技術(shù)

現(xiàn)在是60頁\一共有149頁\編輯于星期三培養(yǎng)細(xì)胞的取材與分離取材部位準(zhǔn)確嚴(yán)格無菌操作盡快培養(yǎng)減小損傷制備標(biāo)本現(xiàn)在是61頁\一共有149頁\編輯于星期三分散組織機(jī)械分離法消化分離法現(xiàn)在是62頁\一共有149頁\編輯于星期三培養(yǎng)細(xì)胞的純化人工純化（酶消化法，機(jī)械刮除法，反復(fù)貼壁法，克隆法等）自然純化現(xiàn)在是63頁\一共有149頁\編輯于星期三細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇所謂冷凍保存，就是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度，并在此溫度下對其長期保存的過程。而復(fù)蘇就是以一定的復(fù)溫速率將凍存的體外培養(yǎng)物或生物活性材料恢復(fù)到常溫的過程。不論是微生物、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進(jìn)行凍存，并在適當(dāng)條件下復(fù)蘇。

現(xiàn)在是64頁\一共有149頁\編輯于星期三低溫保護(hù)劑的應(yīng)用在細(xì)胞凍存時加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷?，F(xiàn)在是65頁\一共有149頁\編輯于星期三

凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融

當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。

如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。現(xiàn)在是66頁\一共有149頁\編輯于星期三常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法

現(xiàn)在是67頁\一共有149頁\編輯于星期三原代培養(yǎng)取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。

現(xiàn)在是68頁\一共有149頁\編輯于星期三細(xì)胞培養(yǎng)的污染、檢測與控制

現(xiàn)在是69頁\一共有149頁\編輯于星期三微生物污染空氣、器材、操作、試劑、組織標(biāo)本現(xiàn)在是70頁\一共有149頁\編輯于星期三微生物污染的檢測細(xì)菌和真菌的污染和檢測肉眼直接觀察法培養(yǎng)檢查法顯微鏡觀察法現(xiàn)在是71頁\一共有149頁\編輯于星期三現(xiàn)在是72頁\一共有149頁\編輯于星期三現(xiàn)在是73頁\一共有149頁\編輯于星期三支原體的污染和檢測造成支原體高污染率的原因：1.支原體大小0.1－0.8um，無細(xì)胞壁，可透過一般過濾膜（0.22-0.45um）；

2.支原體污染時，沒有明顯的肉眼或一般光學(xué)顯微鏡可觀察到的特征變化；

3.過去缺乏簡單、快速且可靠的檢測方式；

4.細(xì)胞流通間缺乏物品管理，造成實(shí)驗(yàn)室間的相互污染；

5.研究或操作人員忽略污染問題；6.已受污染的細(xì)胞；

7.已受污染的培養(yǎng)基、血清?，F(xiàn)在是74頁\一共有149頁\編輯于星期三支原體之檢測：

相差顯微鏡觀察法、電鏡法Hayflick培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法DNA熒光染色法

PCR方法現(xiàn)在是75頁\一共有149頁\編輯于星期三現(xiàn)在是76頁\一共有149頁\編輯于星期三現(xiàn)在是77頁\一共有149頁\編輯于星期三微生物污染的控制抗生素除菌法加溫處理現(xiàn)在是78頁\一共有149頁\編輯于星期三化學(xué)污染細(xì)胞交叉污染現(xiàn)在是79頁\一共有149頁\編輯于星期三第二節(jié)口腔醫(yī)學(xué)中相關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)及其特點(diǎn)一、牙齒相關(guān)細(xì)胞現(xiàn)在是80頁\一共有149頁\編輯于星期三牙髓細(xì)胞現(xiàn)在是81頁\一共有149頁\編輯于星期三培養(yǎng)中的細(xì)胞成分：成纖維細(xì)胞未分化的間充質(zhì)細(xì)胞現(xiàn)在是82頁\一共有149頁\編輯于星期三

培養(yǎng)方法取材浸泡修剪鋪瓶培養(yǎng)現(xiàn)在是83頁\一共有149頁\編輯于星期三

細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)現(xiàn)在是84頁\一共有149頁\編輯于星期三

免疫組織化學(xué)染色波形絲蛋白表達(dá)陽性角蛋白、神經(jīng)絲蛋白、結(jié)蛋白、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白表達(dá)陰性現(xiàn)在是85頁\一共有149頁\編輯于星期三

生長增殖特點(diǎn)成功率快速增殖期死亡現(xiàn)在是86頁\一共有149頁\編輯于星期三

功能特點(diǎn)堿性磷酸酶活性礦化現(xiàn)象對鈣調(diào)節(jié)因子的作用對細(xì)胞因子的反應(yīng)對氫氧化鈣、羥基磷灰石蓋髓劑的反應(yīng)現(xiàn)在是87頁\一共有149頁\編輯于星期三牙周膜細(xì)胞現(xiàn)在是88頁\一共有149頁\編輯于星期三

培養(yǎng)方法取材浸泡修剪鋪瓶培養(yǎng)現(xiàn)在是89頁\一共有149頁\編輯于星期三培養(yǎng)中的細(xì)胞成分：成纖維細(xì)胞未分化的間充質(zhì)細(xì)胞現(xiàn)在是90頁\一共有149頁\編輯于星期三

細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)現(xiàn)在是91頁\一共有149頁\編輯于星期三

免疫組織化學(xué)染色波形絲蛋白表達(dá)陽性角蛋白、神經(jīng)絲蛋白、結(jié)蛋白、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白表達(dá)陰性現(xiàn)在是92頁\一共有149頁\編輯于星期三

生長增殖特點(diǎn)成功率快速增殖期死亡現(xiàn)在是93頁\一共有149頁\編輯于星期三

功能特點(diǎn)分泌功能礦化功能收縮功能附著能力再生能力現(xiàn)在是94頁\一共有149頁\編輯于星期三

增殖分化影響因素生長因子胰島素纖維粘連蛋白抗壞血酸羥基磷灰石現(xiàn)在是95頁\一共有149頁\編輯于星期三二、唾液腺細(xì)胞現(xiàn)在是96頁\一共有149頁\編輯于星期三

細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)腺泡上皮細(xì)胞導(dǎo)管上皮細(xì)胞肌上皮細(xì)胞現(xiàn)在是97頁\一共有149頁\編輯于星期三

免疫組織化學(xué)染色腺泡上皮細(xì)胞：角蛋白、淀粉酶、對氨基水楊酸、導(dǎo)管上皮膜、前角蛋白、單克隆角蛋白、分泌成分陽性反應(yīng)導(dǎo)管上皮細(xì)胞：角蛋白、上皮膜蛋白、磷酸酐酶抗體染色陽性反應(yīng)肌上皮細(xì)胞：肌動蛋白、S－100蛋白、肌凝蛋白抗體染色陽性反應(yīng)現(xiàn)在是98頁\一共有149頁\編輯于星期三

功能特點(diǎn)分泌功能腺泡細(xì)胞：淀粉酶、PRP、唾液過氧化物酶、特異蛋白等腺泡上皮細(xì)胞：頂端分泌、基底及側(cè)膜分泌導(dǎo)管細(xì)胞：膠原肌上皮細(xì)胞：膠原現(xiàn)在是99頁\一共有149頁\編輯于星期三

唾液腺細(xì)胞的增殖分化基底潛能干細(xì)胞理論單細(xì)胞全能干細(xì)胞理論雙細(xì)胞亞全能干細(xì)胞理論現(xiàn)在是100頁\一共有149頁\編輯于星期三

增殖分化功能影響因素細(xì)胞因子激素細(xì)胞外基質(zhì)鈣離子現(xiàn)在是101頁\一共有149頁\編輯于星期三三、口腔粘膜細(xì)胞現(xiàn)在是102頁\一共有149頁\編輯于星期三

培養(yǎng)方法組織塊法酶消化法現(xiàn)在是103頁\一共有149頁\編輯于星期三

細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)現(xiàn)在是104頁\一共有149頁\編輯于星期三

免疫組織化學(xué)染色波形絲蛋白表達(dá)陰性多種角蛋白表達(dá)陽性現(xiàn)在是105頁\一共有149頁\編輯于星期三

功能分泌：膠原蛋白和非膠原蛋白金屬蛋白酶現(xiàn)在是106頁\一共有149頁\編輯于星期三四、頜骨相關(guān)的硬組織細(xì)胞現(xiàn)在是107頁\一共有149頁\編輯于星期三破骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)組織化學(xué)染色特點(diǎn)功能現(xiàn)在是108頁\一共有149頁\編輯于星期三成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)免疫組織化學(xué)染色特點(diǎn)功能：成骨作用對破骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用現(xiàn)在是109頁\一共有149頁\編輯于星期三軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)組織化學(xué)染色特點(diǎn)功能影響軟骨細(xì)胞功能分化的因素現(xiàn)在是110頁\一共有149頁\編輯于星期三五、口腔腫瘤細(xì)胞現(xiàn)在是111頁\一共有149頁\編輯于星期三培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性

腫瘤細(xì)胞與體內(nèi)正常細(xì)胞相比，不論在體內(nèi)或在體外，在形態(tài)、生長增值、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。生長在體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞和在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，其差異較小，但也并非完全相同?，F(xiàn)在是112頁\一共有149頁\編輯于星期三形態(tài)和性狀

培養(yǎng)中癌細(xì)胞無光學(xué)顯微鏡下特異形態(tài)，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞鏡下觀察比二倍體細(xì)胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯，核糖體顆粒豐富。電鏡觀察癌細(xì)胞表面的微絨毛多而細(xì)密，微絲走行不如正常細(xì)胞規(guī)則，可能與腫瘤細(xì)胞具有不定向運(yùn)動和錨著不依賴性有關(guān)。現(xiàn)在是113頁\一共有149頁\編輯于星期三生長增殖

腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)具有不受控增殖性，在體外培養(yǎng)中仍如此。正常二倍體細(xì)胞在體外培養(yǎng)中不加血清不能增殖，是因血清中含有很細(xì)胞增殖生長的因子，而癌細(xì)胞在低血清中（2％～5％）仍能生長。已證明腫瘤細(xì)胞有自泌或內(nèi)泌性產(chǎn)生促增殖因子能力。正常細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后，出現(xiàn)能在低血清培養(yǎng)基中生長的現(xiàn)象，已成為檢測細(xì)胞惡變的一個指標(biāo)。癌細(xì)胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后的單個細(xì)胞培養(yǎng)時，形成集落（克?。┑哪芰Ρ日＜?xì)胞強(qiáng)。另外癌細(xì)胞增殖數(shù)量增多擴(kuò)展時，接觸抑制消除，細(xì)胞能相互重疊向三維空間發(fā)展，形成堆積物。

現(xiàn)在是114頁\一共有149頁\編輯于星期三永生性

永生性也稱不死性。在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為細(xì)胞可無限傳代而不凋亡。體外培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株都表現(xiàn)有這種性狀?，F(xiàn)在是115頁\一共有149頁\編輯于星期三浸潤性

浸潤性是腫瘤細(xì)胞擴(kuò)張性增殖行為，培養(yǎng)癌細(xì)胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養(yǎng)時，能浸潤入其它組織細(xì)胞中，并有穿透人工隔膜生長的能力。

現(xiàn)在是116頁\一共有149頁\編輯于星期三異質(zhì)性

所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態(tài)等性狀不同的細(xì)胞組成。異質(zhì)性構(gòu)成同一腫瘤內(nèi)細(xì)胞的活力有差別的瘤組織；處于瘤體周邊區(qū)的細(xì)胞獲得血液供應(yīng)多，增殖旺盛，中心區(qū)有的細(xì)胞衰老退化，有的處于周期阻滯狀態(tài)，那些呈活躍增殖狀態(tài)的細(xì)胞稱干細(xì)胞（StemCells）、只有這些干細(xì)胞才是支持腫瘤生長的成分?，F(xiàn)在是117頁\一共有149頁\編輯于星期三細(xì)胞遺傳

大多數(shù)腫瘤細(xì)胞有遺傳學(xué)改變，如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。腫瘤細(xì)胞群常由多個細(xì)胞群組成，有干細(xì)胞系和數(shù)個亞系，并不斷進(jìn)行著適應(yīng)性演變?，F(xiàn)在是118頁\一共有149頁\編輯于星期三

培養(yǎng)方法

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細(xì)胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個方面。在具體培養(yǎng)方法方面，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與正常組織細(xì)胞培養(yǎng)并無原則差別，初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可?，F(xiàn)在是119頁\一共有149頁\編輯于星期三口腔鱗癌細(xì)胞：舌鱗狀細(xì)胞癌系涎腺腫瘤細(xì)胞：人黏液表皮樣癌系腺樣囊性癌系來源生物學(xué)特性來源生物學(xué)特性來源生物學(xué)特性現(xiàn)在是120頁\一共有149頁\編輯于星期三第三節(jié)口腔組織工程與干細(xì)胞一、組織工程的基本原理現(xiàn)在是121頁\一共有149頁\編輯于星期三現(xiàn)在是122頁\一共有149頁\編輯于星期三修復(fù)缺損器官的方法自體移植異體移植組織代用品現(xiàn)在是123頁\一共有149頁\編輯于星期三組織工程的基本原理和方法組織工程是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理,將人體某部分的組織細(xì)胞種植和吸附在一種生物材料的支架上進(jìn)行人工培養(yǎng)繁殖,擴(kuò)增,然后移植到人體內(nèi)所需要的部位,從而達(dá)到器官修復(fù)或再造的治療目的的一種技術(shù).現(xiàn)在是124頁\一共有149頁\編輯于星期三現(xiàn)在是125頁\一共有149頁\編輯于星期三組織工程的核心問題是：建立由細(xì)胞和生物材料構(gòu)成的三維空間復(fù)合體現(xiàn)在是126頁\一共有149頁\編輯于星期三優(yōu)點(diǎn)：形成具有生命力的活體組織用最少量的組織細(xì)胞修復(fù)大塊組織缺損任意塑形現(xiàn)在是127頁\一共有149頁\編輯于星期三組織工程的關(guān)鍵技術(shù):

組織構(gòu)成細(xì)胞的培養(yǎng)

生物組織是由實(shí)質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成。對于組織工程來說，首先要求獲取所要培養(yǎng)組織的細(xì)胞。細(xì)胞可來源于自體細(xì)胞，這是一種較常規(guī)的選擇，可以避免機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)，但是受到種類、數(shù)量、時間等限制。因此必須考慮其它方式來獲取細(xì)胞，如應(yīng)用治療性克隆技術(shù)從胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成組織特異干細(xì)胞或應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得工程細(xì)胞。獲取細(xì)胞后，還要研究細(xì)胞擴(kuò)增防老化技術(shù)及其機(jī)理，干細(xì)胞快速、規(guī)模擴(kuò)增等問題?，F(xiàn)在是128頁\一共有149頁\編輯于星期三生物材料及構(gòu)架制備

為了形成具有三維結(jié)構(gòu)的組織，必須提供一個構(gòu)架，構(gòu)架選擇的聚合體必須有足夠的彈性提供細(xì)胞一個類似生命體的力學(xué)環(huán)境，充分多的孔隙允許培養(yǎng)液浸潤生長的組織，傳輸營養(yǎng)物質(zhì)和清除細(xì)胞代謝廢物，隨著組織的生長能夠自我降解，但是降解速度不能太快，要有足夠的時間保證細(xì)胞長進(jìn)去，及時填補(bǔ)聚合體溶解留下的空隙。所以必須用多分支的、多孔滲水的聚合物材料制作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)架，常用的有聚羥基乙酸、聚乳酸類等生物材料。其關(guān)鍵技術(shù)主要包括基體材料改性、表面修飾、表面活性組裝、降解速率調(diào)控、三維構(gòu)架設(shè)計(jì)和制備等等。現(xiàn)在是129頁\一共有149頁\編輯于星期三良好的生物相容性生物降解性良好的表面活性具有多孔性組織工程支架材料的要求：現(xiàn)在是130頁\一共有149頁\編輯于星期三生物組織工程化培養(yǎng)系統(tǒng)的研究