雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體公開課課件

第12章雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體新民周刊2010,5.17-23.P76-92010.11.2：世界肺炎日（第2個）全球每年約有160萬人死于肺炎鏈球菌疾病，平均每38秒1名5歲下兒童死于此病，1100萬兒童因肺炎住院。中國是10個肺炎發(fā)病率最高的國家之一，1/4兒童攜帶病菌；死亡兒童該病占46.8%。占西太平洋區(qū)的70%。紅霉素不敏感幾乎達到100%，青霉素達86%。1983年23價肺炎鏈球菌夾膜多糖疫苗PPV23誕生。2000年針對2歲以下兒童的7價肺炎鏈球菌蛋白結(jié)合疫苗PPV7問世。目前已經(jīng)接種3億劑，世界第一大單個疫苗。2003年SARS病毒SARS病毒屬于冠狀病毒科，病毒粒子多呈圓形，有囊膜，外周有冠狀排列的纖突，病毒直徑在80-120nm之間。感染病毒的細胞線粒體腫脹，部分線粒體外膜或嵴溶解，病毒顆粒主要分布在胞漿的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池、胞漿空泡內(nèi)和細胞外，多聚集成堆。12-1

雜交瘤技術(shù)將骨髓瘤細胞與免疫的動物脾細胞融合得到即能夠分泌抗體又能在體外長期繁殖的雜交瘤細胞，經(jīng)過克隆化培養(yǎng)得到可以分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞，這種技術(shù)通稱為雜交瘤技術(shù)（hydridomatechnique）。歷史發(fā)現(xiàn)1975年，英國劍橋大學分子生物學研究室將已適應于體外培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細胞與綿羊紅細胞免疫小鼠脾細胞（B淋巴細胞）進行融合，發(fā)現(xiàn)融合形成的雜交瘤細胞具有雙親細胞的特征：即像骨髓瘤細胞一樣在體外培養(yǎng)中能夠無限地快速增殖，又能持續(xù)地分泌特異性抗體?？评眨↘ohler）米爾斯坦（Milstein）（一）免疫學基礎(chǔ)1抗原：進入動物體內(nèi)對肌體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生刺激作用的外源物質(zhì)。包括：蛋白質(zhì)、多糖、核酸、病毒、細菌、各種細胞等。特點：結(jié)構(gòu)表位性（抗原決定簇

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單克隆抗體免疫原特異性：（抗原與抗體的反應）抗原---刺激免疫系統(tǒng)---發(fā)生免疫應答-----產(chǎn)生應答產(chǎn)物。18T細胞與B細胞抗原決定簇的比較2抗體互補性決定區(qū)（Complementaritydeterminingregion，CDR）VH和VL的三個高變區(qū)共同組成Ig的抗原結(jié)合部位。該部位形成一個與抗原決定簇互補的表面，決定抗體的多樣性與特異性。動物免疫系統(tǒng)分泌的中和或消除抗原物質(zhì)的影響的物質(zhì)，存在于血清中，本質(zhì)是免疫球蛋白（Immuniglobulin,Ig）。?C：constantregion?V：variableregion抗體的來源免疫系統(tǒng)：包括體液免疫和細胞免疫，參與的細胞包括B淋巴細胞——發(fā)育成漿細胞，分泌抗體，參與體液免疫，脾臟可以分泌。T淋巴細胞——發(fā)育成吞噬細胞，直接參與細胞免疫，經(jīng)胸腺分泌。不能產(chǎn)生抗體，幫助B淋巴細胞產(chǎn)生抗體。問題的引出血液得到的只能是混合抗體，但是需要大量的僅針對某一個抗原決定族的單克隆抗體，幾乎是不可能的，因此必須采用其他方法。3單克隆抗體生產(chǎn)途徑：細胞融合：雜交瘤細胞病毒轉(zhuǎn)化：獲得永久生長的B淋巴細胞視頻：d_XMTY1ODg5MDI0.html(三）雜交瘤制備單克隆抗體單克隆抗體技術(shù)分非特異性、特異性兩類2.骨髓瘤細胞株的培養(yǎng)與篩選骨髓瘤細胞系應和免疫B淋巴細胞源于同一品系動物（如BALB/C小鼠），這樣雜交融合率高。通常采用HPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）與TK（胸腺嘧啶核苷激酶）缺陷型的骨髓瘤細胞系。HPRT和TK兩種酶參與DNA補救途徑合成。一般在準備融合前的兩周就應開始復蘇骨髓瘤細胞，用老鼠巨噬細胞作飼養(yǎng)層進行培養(yǎng)，取對數(shù)生長期骨髓瘤細胞，進行HAT液敏感性篩選培養(yǎng)。HAT培養(yǎng)基篩選法培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T），所以取三者的字頭稱為HAT培養(yǎng)基。HAT篩選原理DNA的合成：正常途徑：糖、氨基酸——核苷酸——DNA，可以被氨基蝶呤阻斷胸腺嘧啶核苷激酶（TK）補救途徑：核苷酸前體——核苷酸——DNA

次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）需要2種酶的參與4融合細胞的篩選融合的B淋巴細胞和瘤（雜交瘤）細胞、融合的B淋巴細胞、融合的瘤細胞、未融合的B淋巴細胞、未融合的瘤細胞以及細胞的多聚體等。正常的B淋巴細胞在培養(yǎng)基中存活僅5～7天，無需特別篩選，細胞的多聚體形式也容易死去。剩余：B淋巴細胞與瘤細胞的雜交瘤細胞+未融合的瘤細胞+融合的瘤細胞，其中后兩種需進行特別的HAT液培養(yǎng)篩選去除。融合后的細胞類型：（1）氨基蝶呤可阻斷細胞正常途徑合成DNA，因此HAT培養(yǎng)基上的細胞不能采用該途徑合成DNA。（2）融合的瘤細胞一般是HPRT與TK缺陷型，因此也不能采用補救途徑合成DNA。兩條途徑被阻斷后，有怎樣的結(jié)果呢？瘤細胞（未融合的和多聚體）命運：因不能正常合成DNA而死亡。融合雜交瘤細胞：具有親代雙方的遺傳性能，具有來自于淋巴細胞內(nèi)的HPRT與TK，因此可利用培養(yǎng)基中的嘌呤與嘧啶采用補救途徑合成DNA，因此可在HAT培養(yǎng)基中存活與繁殖。HAT篩選雜交瘤細胞H,次黃嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶5.雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)將融合的雜交瘤細胞進行充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的數(shù)個細胞之間，培養(yǎng)。取上清以ELISA法篩選出針對目標抗原的抗體分泌性高的雜交瘤細胞株，增殖后凍存。7.單克隆抗體的大量制備（1）血清法對數(shù)生長期的雜交瘤細胞按1～3×107cells／ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml。待腫瘤達到一定大小后(一般10～20天)則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達到1-10mg／ml。缺點是采血量有限。（一）體內(nèi)接種法（2）腹水制備法腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達5～20mg/ml，這是目前最常用的方法。人—鼠雜交瘤：融合方法基本與鼠—鼠雜交瘤相同。親本骨髓瘤細胞是小鼠骨髓瘤細胞，親本B細胞則來源于人外周血淋巴細胞、淋巴結(jié)細胞、脾細胞。但是，人—鼠雜交瘤的人單克隆抗體分泌性能很不穩(wěn)定，多數(shù)情況下雜交瘤會很快失去抗體分泌能力