實(shí)驗(yàn)1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離課件

實(shí)驗(yàn)1：大腸桿菌的培養(yǎng)和分離微生物包括哪五類：病毒細(xì)菌放線菌真菌原生生物特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,形體微小.通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu).且體內(nèi)一般不含有葉綠素.不能進(jìn)行光合作用.原核生物界原生生物界真菌界病毒界一、基礎(chǔ)知識(shí)：

(一)微生物大腸桿菌（E.coli）分布：人和哺乳動(dòng)物腸道，此外還廣泛分布于水、污水、土壤、谷類、乳制品等當(dāng)中。大腸桿菌在人體的_____中一般對(duì)人體無害，但任何大腸桿菌如果進(jìn)入__________都會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害。大腸桿菌是_______工程中被廣泛采用的工具。腸道泌尿系統(tǒng)基因革蘭氏______（填陰或陽）性菌陰代謝類型：異養(yǎng)，兼性厭氧型生長(zhǎng)適宜溫度：質(zhì)粒、EcoRⅠ限制酶、E.coli-DNA連接酶、受體細(xì)胞37℃左右大腸桿菌酵母菌放線菌霉菌菌落：?jiǎn)蝹€(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量生長(zhǎng)繁殖時(shí)，所形成的肉眼可見的具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體。不同微生物形成的菌落具有不同的特征，是鑒定菌種的重要依據(jù)。如菌落的大小、形狀、邊緣、光澤度、顏色、透明度等。菌落的概念白色或乳白色，光滑大腸桿菌菌落：芽孢有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對(duì)干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3小時(shí)以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時(shí)候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個(gè)細(xì)菌.一、基礎(chǔ)知識(shí)：（二）培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長(zhǎng)繁殖使用的混合營(yíng)養(yǎng)液。（1）按物理狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。（2）按功能分：選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。（3）按成分分：天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。1.培養(yǎng)基的類型和用途固體培養(yǎng)基：菌落，菌苔半固體培養(yǎng)基：無動(dòng)力有動(dòng)力(彌散)(是否運(yùn)動(dòng))

選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基:分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:

分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基:分離固氮菌

不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基:分離自養(yǎng)型微生物

加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基:分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基:分離雜交瘤細(xì)胞血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子；③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長(zhǎng)因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。培養(yǎng)基的用途液體培養(yǎng)基：增菌，常用于發(fā)酵工業(yè)固體培養(yǎng)基：增菌，菌種保存及分離純化、鑒定菌落、活菌計(jì)數(shù)等半固體培養(yǎng)基：動(dòng)力檢測(cè)，保種不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方調(diào)節(jié)pH2、成分水、碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子(生長(zhǎng)因子即細(xì)菌生長(zhǎng)必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)真菌：5～6細(xì)菌：6.5～7.5有時(shí)會(huì)加一定量的氯化鈉以維持一定的滲透壓比較消毒與滅菌比較項(xiàng)理化因素的作用強(qiáng)度消滅微生物的數(shù)量芽孢和孢子能否被消滅消毒滅菌較為溫和部分生活狀態(tài)的微生物不能能全部微生物強(qiáng)烈高壓蒸汽滅菌（濕熱滅菌）灑精燈灼燒滅菌干熱滅菌（1）滅菌方法：3、常用的滅菌和消毒的方法培養(yǎng)基、無菌水、各種耐高溫的玻璃金屬器具100kPa、121℃下維持15-30min需要保持干燥耐高溫的玻璃金屬器皿160-170℃下加熱1-2h接種環(huán)等金屬器具請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。（一）制備LB培養(yǎng)基（通用的細(xì)菌培養(yǎng)基）1、配方：蛋白胨0.5克，酵母提取物0.25克，氯化鈉0.5克，水50ml（配固體培養(yǎng)基再加瓊脂1克）溶解計(jì)算稱量調(diào)pH分裝加塞，包扎2、流程二操作步驟滅菌倒平板①分裝：注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，因此在將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到三角瓶或試管中時(shí)必須用__________。②加塞：試管用塑料蓋或________；三角瓶口用_______或_________封口,再用_________或報(bào)紙封口。③包扎：用________或報(bào)紙三角漏斗棉花塞封口膜6層紗布牛皮紙牛皮紙高壓蒸氣滅菌法④滅菌1）加水：2）裝鍋：向外層鍋內(nèi)加入適量的水，加水的要求是_________.物品放置的要求______________________：加蓋：將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌桶的_______內(nèi)。再以________方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。不觸及內(nèi)膽整齊、穩(wěn)定、留出空隙排氣槽兩兩對(duì)稱倒平板：待培養(yǎng)基冷卻至_____℃時(shí)，將每只培養(yǎng)皿倒入_________ml未凝固的固體培養(yǎng)基，置于_____位置上，輕輕晃動(dòng)使其均勻鋪滿平皿底部，待凝，使之形成平面。_______備用。制斜面：將未凝固的固體培養(yǎng)基的試管____放，冷卻待凝使即成為斜面。６０10～12水平倒置斜⑤倒平板、制斜面操作平臺(tái)：滅菌好的培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)器具置于超凈臺(tái)上打開_________和___________，滅菌30min.過濾風(fēng)紫外線超凈臺(tái)思考題：A、操作過程中避免帶入雜菌的方法有哪些？1、滅菌后的培養(yǎng)基、器具置于超凈臺(tái)上，并打開超凈臺(tái)的紫外燈和過濾風(fēng)，滅菌30分鐘。2、用鑷子夾出灑精棉球擦拭桌面和實(shí)驗(yàn)者雙手。3、整個(gè)操作在酒精燈火焰旁進(jìn)行4、打開后或加塞前試管口、三角瓶口灼燒滅菌。B、培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到60后才倒平板，你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度呢？可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。（三）平板劃線分離法主要器具：操作過程：注意：無菌操作方法：同前。將培養(yǎng)皿______（蓋在下），放于_____℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)__________小時(shí)。在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，要從上一次劃線的開始________劃線。接種環(huán)、思考：若如上圖所示進(jìn)行劃線分離，則接種環(huán)總共進(jìn)行幾次灼燒滅菌？恒溫培養(yǎng)箱。每次劃線前接種環(huán)都要灼燒滅菌，再冷卻。末端１２～２４倒置３７平板劃線的操作方法交叉劃線法連續(xù)劃線法

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？

操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到單個(gè)菌落。2、在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。3.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。4.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。5、如何判斷接種操作是否符合無菌要求？如果培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點(diǎn)，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達(dá)到要求。（四）稀釋涂布平板法主要器具：玻璃三角刮刀、移液管或吸管操作過程：先將培養(yǎng)菌液稀釋（10-5~10-7倍）用移液管或吸管取0.1ml稀釋度不同的菌液，加在平板上，用無菌玻璃三角刮刀均勻涂布在培養(yǎng)基平面上。在適當(dāng)稀釋度下，可培養(yǎng)得到相互分開的的菌落。將培養(yǎng)皿倒置（蓋在下），放于３７℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)１２～２４小時(shí)。劃線分離方法簡(jiǎn)單；涂布分離，易形成單菌落，但操作復(fù)雜些。10g土樣從土壤中分離微生物稀釋涂布法（五）斜面接種及菌種保存主要器具：操作過程：在無菌操作下，用接種環(huán)挑取___菌落，再用劃線法（自斜面底部向上輕輕劃直線）接種在_____上，_____℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)____小時(shí)后，____℃冰箱保存。無菌操作：同前試管斜面培養(yǎng)基密閉效果比平面的好很多,不容易進(jìn)入雜菌，同時(shí)能用來做純細(xì)菌的長(zhǎng)期保存。思考：菌種保存為何采用斜面而不是平板？接種環(huán)、恒溫箱、冰箱單斜面３７２４４菌種的保存1、臨時(shí)保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長(zhǎng)成后置于4℃冰箱保存。2、長(zhǎng)期保存：甘油冷凍管藏法思考題？利用培養(yǎng)基技術(shù)不僅可以分離微生物，也可以進(jìn)行植物組織培養(yǎng)。請(qǐng)簡(jiǎn)要說明這兩項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用設(shè)計(jì)思路的相同點(diǎn)以及區(qū)別。相同點(diǎn)：都是從培養(yǎng)對(duì)象所需的營(yíng)養(yǎng)條件出發(fā)，配置適宜培養(yǎng)基。都要求嚴(yán)格的無菌條件。不同點(diǎn)：植物組織培養(yǎng)往往還要加入激素。例1．關(guān)微生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的A.是碳源的物質(zhì)不可能同時(shí)是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無機(jī)物只提供無機(jī)鹽D.無機(jī)氮源也能提供能量D編號(hào)成分含量①粉狀硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml例2．右表是某微生物培養(yǎng)基成分，請(qǐng)據(jù)此回答：（1）右表培養(yǎng)基可培養(yǎng)的微生物類型是

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