基因工程的基本操作程序課件新人教選修

基因工程的基本操作程序課件新人教選修第1頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四基因工程基本操作的四個(gè)步驟1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測與鑒定第2頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四一、目的基因的獲取(一)、目的基因主要是______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因請舉出三個(gè)以上的例子（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些?1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增3、人工合成請閱讀P9第一和二兩段第3頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四1.目的基因的獲?。?）直接從生物體中提取總DNA，構(gòu)建基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)，從中調(diào)用目的基因；第4頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四

基因組DNA文庫的構(gòu)建將總DNA經(jīng)過酶解，分離不同長短的DNA片段。包含的基因組片段分別克隆在質(zhì)粒或噬菌體載體上，轉(zhuǎn)染細(xì)菌或體外包裝到噬菌體顆粒上便構(gòu)成了該生物的基因組文庫。第5頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四①基因組文庫的構(gòu)建（2）.基因文庫的構(gòu)建方法通過對受體菌的培養(yǎng)而儲存基因第6頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四②cDNA文庫的構(gòu)建-----反轉(zhuǎn)錄法：

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA單鏈DNA反轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶雙鏈DNA(目的基因)第7頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四第8頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四cDNA(互補(bǔ)DNA)：是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)的mRNA經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄后形成的互補(bǔ)DNA片段，與載體連接后儲存在一個(gè)受體菌群中，這個(gè)受體菌群就叫做這種生物的cDNA文庫2)cDNA文庫(cDNAlibrary)基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA第9頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四1、原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄第10頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)②有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列.包括啟動(dòng)子和終止子非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動(dòng)子終止子第11頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四2、真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子：外顯子：第12頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的3、原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼第13頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四基因組文庫和部分基因組文庫(cDNA文庫)比較第14頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢?第15頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA

基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性④從基因文庫中得到目的基因的方法第16頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因第17頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四①概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________、

_______________、___________、____________________等②原理：__________④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制四種脫氧核苷酸一對引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提條件）第18頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四⑥過程：a、高溫變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈第19頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四第20頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四3、人工合成法：基因較小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成儀人工合成第21頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建4、切割質(zhì)粒和目的基因的限制性內(nèi)切酶是否要求一樣？為什么？2、表達(dá)載體至少帶有哪些結(jié)構(gòu)？各有什么作用？思考：3、構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)需要哪些工具？1、這步是基因工程的核心，構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的是什么？——

核心第22頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建

——基因工程的核心1、目的：所需物質(zhì)：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。它們各自的作用是什么?第23頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四啟動(dòng)子：位于基因首端，RNA聚合酶識別和結(jié)合部位，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄終止子：位于基因尾端，終止轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因：鑒別受體細(xì)胞內(nèi)是否含目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來目的基因：外源DNA分子的有效片段。第24頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四1.用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。2.用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個(gè)重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同(二).過程第25頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵③啟動(dòng)子、終止子對于目的基因表達(dá)必不可少④目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。注意第26頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1、導(dǎo)入植物細(xì)胞常用的方法是什么？原理是什么？具體過程是怎樣的？3、導(dǎo)入大腸桿菌的方法是怎樣的？鈣離子有什么作用？2、導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎樣的？第27頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四三將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)化：（二）方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)第28頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四1.目的基因?qū)胫参锛?xì)胞：

目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程A.轉(zhuǎn)化的概念：B.農(nóng)桿菌的特點(diǎn)

農(nóng)桿菌易感雙子葉和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力(1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法C、原理：Ti質(zhì)粒上的T---DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。第29頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四（2）過程目的基因插入到____________,構(gòu)建___________,______菌______細(xì)胞整合到______細(xì)胞的____________上,_________.轉(zhuǎn)入侵染

④優(yōu)點(diǎn):比較經(jīng)濟(jì)和有效第30頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四（2）基因槍法（3）花粉管通道法第31頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四2.目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（１）．方法:顯微注射技術(shù)（２）基本操作程序：含有目的基因的表達(dá)載體______顯微注射受精卵移植到雌性動(dòng)物體的＿＿＿＿，輸卵管或子宮內(nèi)提純?nèi)÷眩ǎ┦芫咽拱l(fā)育成為具新現(xiàn)狀的動(dòng)物第32頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞（1）思考：為什么選用微生物作為受體細(xì)胞？繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少(２)．最常用的原核細(xì)胞_____________（３）轉(zhuǎn)化方法:第一步：用_____處理細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的狀態(tài)（_________細(xì)胞）第二步：將溶于_______緩沖液中與＿＿＿＿＿細(xì)胞混合，在一定溫度下促進(jìn)________細(xì)胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化過程表達(dá)載體感受態(tài)感受態(tài)感受態(tài)Ca2+第33頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第34頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四(四)目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功檢測—①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法——方法——方法——DNA分子雜交法

分子雜交技術(shù)抗原抗體雜交法分子水平的檢測第35頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四1、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因①.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針③.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中（1）方法:DNA分子雜交幻燈片37（2）過程:第36頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四DNA分子雜交示意圖

采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。P15思考與探究第37頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四基因探針（DNA探針）與目的基因雜交，有無雜交帶第38頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四2、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)①方法:分子雜交方法:抗原抗體雜交②過程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA第39頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四檢測二：個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定

用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。鑒定——抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等第40頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法目的基因的檢測與鑒定檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定：第41頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的

處，DNA連接酶作用于

處。（填“a”或“b”）第42頁，共46頁，2023年，2月20日，星期四練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（2）將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和