超氧化物歧化酶活性的測定

植物組織中超氧化物歧化酶和平測定方法【實驗?zāi)康摹苛私膺€原法測定抗氧化酶活性測定的原理方法。熟悉植物葉片中ROS去除機(jī)制?！緦嶒炘怼砍趸锲缁福⊿OD）普遍存在于動植物與微生物體內(nèi)。SOD是含金屬輔基的酶。高等植物有兩種類型的SOD:Mn-SOD和Cu/Zn-SOD。SOD能夠清除超氧陰離子自由基（02-），它與CAT、POD等酶協(xié)同作用來防御活性氧或其他過氧化物自由基對細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害，從而減少自由基對機(jī)體的毒害。超氧陰離子自由基（O2-）是生物細(xì)胞某些生理生化反應(yīng)常見的中間產(chǎn)物。SOD能通過歧化反應(yīng)清除生物細(xì)胞中的超氧陰離子自由基，生成h2o2和O2。生成的h2o2可被過氧化氫酶分解為02和H2O：SOD2O2-+2H+?H2O2+O22H2O2匹O2+H2O超氧自由基非常不穩(wěn)定，壽命極短，一般用間接方法測定SOD活性。本實驗依據(jù)SOD抑制氮藍(lán)四唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性的大小。有氧化物質(zhì)存在時，核黃素可在光照條件下還原。被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生02-。當(dāng)加入NBT后，在光照條件下02-又可將NBT還原為藍(lán)色的甲腙，后者在560nm處有最大光吸收。當(dāng)加入SOD時，SOD可通過清除02-，而抑制NBT的光還原反應(yīng)，使藍(lán)色甲腙生成速度減慢。于是，進(jìn)行光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色越深，說明酶的活性越低，反之酶的活性越高。抑制NBT光還原的相對百分率與酶活性在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)關(guān)系，據(jù)此可以計算出酶活性的大小。常常將抑制50%的NBT光還原反應(yīng)時所需的酶量作為一個酶活性單位（U）?！酒鞑呐c試劑】實驗儀器與用具研缽、高速冷凍離心機(jī)、分光光度計、微量移液槍、刻度移液管、離心管、光照箱（光照度為4000lx）、容量瓶（10ml）、試管實驗試劑50mmol/L磷酸緩沖液（pH7.8）；130mmol/L甲硫氨酸（MET）溶液；750四mol/L氮藍(lán)四唑（NBT）溶液；100|imol/LEDTA-Na2溶液；20四mol/L核黃素溶液；SOD提取介質(zhì)：50mmol/L磷酸緩沖液（pH7.8）內(nèi)含1%PVP。實驗材料正常生長或經(jīng)逆境處理的小麥葉片【實驗步驟】1.SOD提取：稱取植物材料0.5g于預(yù)冷的研缽中，加入2ml預(yù)冷的提取介質(zhì)，在冰浴條件下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶中，用提取介質(zhì)沖洗研缽2?3次（每次1?2ml），合并沖洗液于容量瓶中，定容至10ml。取5ml轉(zhuǎn)入到離心管中，于4°C、10000r/min離心15min，收集上清液，即為SOD粗提液?；钚詼y定：取透明度好、質(zhì)底相同的試管4支。測定管2支，光下對照1支，暗中對照1支（調(diào)零）。按下表所列內(nèi)容加入各種溶液（注意最后加入核黃素溶液）。表測定SOD活性時各試劑加入量試劑/ml測定管光下對照暗中對照123450mmol/L磷酸緩沖液(pH7.8)1.51.51.51.5130mmol/LMET溶液0.30.30.30.3750gmol/L氮藍(lán)四唑（NBT）溶液0.30.30.30.3100gmol/LEDTA-Na2溶液0.30.30.30.320gmol/L核黃素溶液0.30.30.30.3粗酶液0.10.100蒸餾水0.50.50.60.64號試官加入核黃素后立即用黑布套遮光，全部試劑加完后搖勻，將試管置于4000lx熒光燈下顯色反應(yīng)15?20min（要求各管照光一?致，反應(yīng)溫度控制在25?35攝氏度）。反應(yīng)結(jié)束后用黑布罩遮蓋住試管終止反應(yīng)。以4號管作空白（調(diào)零），在560nm下測定吸光度，記錄測定數(shù)據(jù)。結(jié)果計算SOD活性（U?g-1FW?h-1）二曳—氣）'匕x60A0x0.5xFWxVsxt式中，A0:光下對照管吸光度；AS:樣品測定管吸光度；Vt:樣品提取液總體積（ml）；VS：粗酶液量；t：顯色反應(yīng)光照時間（min）；FW：樣品鮮重（g）。

【實驗結(jié)果】測定數(shù)據(jù)記錄1（逆境測定管）2（CK測定管）3（光下對照管）4（暗中對照管）吸光度A0.0760.0870.4370.000反應(yīng)時間20min計算逆境下：SOD活性=(0.437-0.076)x10x60

逆境下：SOD活性=(0.437-0.076)x10x60

0.437x0.5x0.5x0.1x20=991.3U-g-1FW-h-1正常環(huán)境下：SOD活性=(0.437-0.087)x10x60

0.437x0.5x0.5x0.1x20=961U?g-1FW?h-1【注意事項】線粒體內(nèi)SOD酶濃度較高