醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)四 小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞的分離

實(shí)驗(yàn)四：小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞的分離熟悉細(xì)胞分離的基本原理掌握小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞的分離免疫細(xì)胞分離方法：根據(jù)不同免疫細(xì)胞表面標(biāo)志:MACS，F(xiàn)ACS

根據(jù)細(xì)胞理化性質(zhì)：

1）根據(jù)細(xì)胞比重差異：自然沉降法、密度梯度離心法、改變細(xì)胞密度法

2）根據(jù)細(xì)胞黏附特性：B細(xì)胞黏附于尼龍棉

3）根據(jù)細(xì)胞對(duì)滲透壓變化的敏感度：紅細(xì)胞對(duì)低滲敏感基本概念2磁性微珠是20世紀(jì)80年代初以高分子材料和金屬離子（如Fe3O4）為原料聚合而成的一種以金屬離子為核心、外層均勻地包裹高分子聚合體的固相微粒。以磁性微珠為載體，包被上針對(duì)某種細(xì)胞表面抗原的特異性抗體即可制成免疫磁性微珠。MACS3流式細(xì)胞儀（flowcytometer）是一種能夠探測和計(jì)數(shù)以單細(xì)胞液體流形式穿過激光束的細(xì)胞檢測裝置，由于在檢測中使用的細(xì)胞標(biāo)志示蹤物質(zhì)為熒光標(biāo)記物，因此，用來分離、鑒定細(xì)胞的流式細(xì)胞儀有被稱為熒光激活細(xì)胞分類儀（fluorescenceactivatedcellsorter,FACS）,是分離和鑒定細(xì)胞群及亞群的一種強(qiáng)而有力的應(yīng)用工具。4

人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcellPBMC)包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其體積、形狀和比重與其他細(xì)胞不同，利用密度在1.077±0.001g/L之間近于等滲的Ficoll-Hypaque混合溶液(稱為淋巴細(xì)胞分層液)作密度梯度離心時(shí),各種血液成分將按密度梯度重新分布聚集。

密度梯度離心法離心后血漿單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）粒細(xì)胞紅細(xì)胞5小鼠脾臟位于上腹部左后側(cè)，體積較大，長條形態(tài)，屬于外周免疫器官。外周血中淋巴細(xì)胞可經(jīng)再循環(huán)注入脾臟等外周免疫器官的特定區(qū)域，所以富含各類免疫細(xì)胞。解剖圖胸腺位于胸腔胸骨后、縱隔前上方，覆蓋在心臟前上方的白色組織。通常小鼠鼠齡越小，胸腺體積相對(duì)越大。6取脾臟（一）取小鼠脾臟（3人1組）小鼠頸椎脫位處死用拇指和食指往下按住鼠頭，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之頸椎脫臼，造成脊髓與腦髓斷離取其后右側(cè)臥位，消毒左側(cè)背腹交界處皮膚，剪取脾臟并盡量將去除脂肪及筋膜組織。實(shí)驗(yàn)步驟712346578910超凈臺(tái)下操作全過程可重復(fù)濾過8（二）制備單個(gè)核細(xì)胞懸液：將脾臟置于盛有5mLPBS緩沖液的平皿中，然后再置于尼龍指套中。用針芯輕輕碾磨使單個(gè)核細(xì)胞通過尼龍指套懸浮于平皿中；吸取平皿中細(xì)胞懸液（再次用尼龍指套過濾）置于刻度離心管中，加PBS緩沖液（可沖洗培養(yǎng)皿）至10mL，以1500rpm離心5min。棄去上清，彈散細(xì)胞沉淀，加ACK3ml，輕輕吹打混勻并放置3-4min，以破壞紅細(xì)胞。然后加PBS緩沖液至10ml，以指套過濾至另一15mL離心管，以1500rpm離心5min；棄去上清，彈散細(xì)胞沉淀，加PBS緩沖液至10ml，吹打混勻即為小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞懸液。取100uL至EP管中，進(jìn)行計(jì)數(shù)和活力測定（建議5倍稀釋）以1500rpm離心5min，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果稀釋到合適的濃度注：減少操作的時(shí)間，并放置冰上或低溫離心機(jī)里以保證細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)步驟9（三）計(jì)算細(xì)胞濃度將上述細(xì)胞懸液做一定倍數(shù)的稀釋；（建議5倍稀釋）混勻稀釋后，取1滴加至細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)板中4大方格細(xì)胞總數(shù)；計(jì)算細(xì)胞總數(shù)：細(xì)胞總數(shù)=平均每個(gè)大方格中細(xì)胞數(shù)（4個(gè)大方格細(xì)胞總數(shù)/4）×104×稀釋倍數(shù)×總體積。實(shí)驗(yàn)步驟10計(jì)數(shù)時(shí)需要遵循一定的方向逐格進(jìn)行以免重復(fù)或遺漏，對(duì)壓線細(xì)胞采用數(shù)左不數(shù)右，數(shù)上不數(shù)下的原則。11（四）計(jì)算細(xì)胞活力1.20μl細(xì)胞懸液+20μl的0.2%苔盼蘭溶液并混勻；2.顯微鏡下觀察：如果細(xì)胞被染成藍(lán)色，旋轉(zhuǎn)顯微鏡微調(diào)節(jié)鈕，細(xì)胞無反光，則為死細(xì)胞；而細(xì)胞不被染色，晶瑩透亮，旋轉(zhuǎn)顯微鏡調(diào)節(jié)鈕，細(xì)胞明顯反光而且有立體感，為活細(xì)胞；3.計(jì)算細(xì)胞活力：計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中活細(xì)胞的百分率，一般活力應(yīng)在95%以上。死細(xì)胞活細(xì)胞12自動(dòng)化細(xì)胞計(jì)數(shù)器Luna?韓國LogosBiosystems公司在5×104

–1×107細(xì)胞/ml的濃度范圍3-60μm的細(xì)胞直徑范圍內(nèi)一塊計(jì)數(shù)板/2組1314注意事項(xiàng)通常分離細(xì)胞是為了下一步實(shí)驗(yàn)。有些實(shí)驗(yàn)如需要對(duì)細(xì)胞作進(jìn)一步培養(yǎng)，則在分離細(xì)胞時(shí)一定要嚴(yán)格無菌操作。在用ACK破壞紅細(xì)胞時(shí)，不要時(shí)間過長，以免破壞其他細(xì)胞。15

16Control50ulPBS+0.5ulAb預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果PE-CD19BcellsAPC-CD3Tcells50ulPBS+2ulAb分析數(shù)據(jù)時(shí)建議只