細胞培養(yǎng)相關(guān)操作

本文格式為Word版，下載可任意編輯——細胞培養(yǎng)相關(guān)操作細胞培養(yǎng)常用操作方法

1細胞復蘇

事先調(diào)理水浴箱至37°C，并將操作所需培養(yǎng)基、PBS溶液等放置于水浴箱。待以上試劑完全溶解，將其取出，置于細胞間密閉交換窗口。更換衣物鞋帽，穿工作服（已經(jīng)紫外照射消毒），佩戴無菌帽子、口罩后進入細胞間，以75%醫(yī)用酒精噴灑超凈臺，將試驗所需物品從密閉交換窗口取出，放入超凈工作臺，再次噴灑75%醫(yī)用酒精，并照射紫外燈消毒超凈臺和物品30min以上，細胞間也要紫外燈消毒。

從-80℃超低溫冰箱中取出細胞凍存管，快速放置于37\水浴箱中，充分搖動，盡量使細胞在Imin內(nèi)快速解凍。

細胞凍存管經(jīng)75%醫(yī)用酒精消毒后放入超凈臺，瓶蓋充分過火焰開啟，用滴管將凍存管內(nèi)的細胞懸液移至含5ml1640完全培養(yǎng)液的15ml離心管中，反復吹打，1000rpm常溫離心3-5min。

離心完畢后，防備棄去離心管上清液，取5ml1640完全培養(yǎng)液參與15ml離心管中輕輕打勻，以制備單細胞懸液，將懸液防備移至細胞培養(yǎng)瓶中，參與適量1640完全培養(yǎng)液（以充分浸沒細胞培養(yǎng)瓶瓶底為宜），十字搖勻，放置于37℃，含5%C02的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2細胞傳代

依照前述方法常規(guī)消毒超凈工作臺

旋開細胞培養(yǎng)瓶，將瓶中培養(yǎng)液防備棄入廢液缸。向瓶中參與適量PBS沖洗，旋緊瓶蓋左右水平晃動，要求動作輕柔，PBS洗漆兩次后，參與3ml胰酶消化液，以剛好覆蓋瓶底為宜，消化時間為90s。期間應(yīng)隨時注意觀測顯微鏡下的細胞狀態(tài)，并輕輕水平晃動細胞培養(yǎng)瓶，待到目測約有70%細胞脫落時，參與6ml1640完全培養(yǎng)液中和胰酶，劑量剛好為胰酶的兩倍，以滴管反復吹打瓶底細胞，注意變換不同角度和位置以使吹打范圍覆蓋瓶底每個角落，直至所有細胞完全脫落。

將瓶中細胞懸液移至15ml離心管中，1200rpm離心3min，防備取出離心管，不可震蕩，棄去上清，參與適量新鮮培養(yǎng)液，滴管充分吹打，制備成單細胞懸液，將懸液分別移入兩個培養(yǎng)瓶中，十字搖勻，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

3細胞凍存

取對數(shù)生長期細胞，要求事先經(jīng)顯微鏡下觀測確認無細菌或支原體污染，且細胞形態(tài)良好，胞質(zhì)透亮明了。需要注意，凍存細胞前24小時之內(nèi)需進行細胞換液，以保證細胞處于最正確生長狀態(tài)。

計數(shù)：依照細胞常規(guī)傳代方法將細胞消化后制成單細胞懸液，使用計數(shù)板將細胞密度調(diào)整到5×106個/ml。一般狀況下，對于250cm2的大號培養(yǎng)瓶，細胞長滿瓶底后，剛好可供凍滿四個1.8ml的凍存管。

凍存液：凍存所用培養(yǎng)液為含有20%胎牛血清的無藥無抗1640培養(yǎng)液，所用細胞凍存管及甘油均已事先高壓滅菌，先向每支細胞凍存管中參與200^1甘油，再分別參與1.6ml的單細胞懸液，輕柔吹打，使甘油與單細胞懸液充分混勻，力度不宜過大，否則會導致液體溢出管口。

保存：管口充分過火后拉緊并用封口膠封嚴，以免細胞復蘇時造成污染。依次對各管分別標記，凍存管先于4°C冰箱放置20min，后移入-20°C繼續(xù)放置2小時，最終置于-80℃超低溫冰箱中。一般狀況下可保存3個月，如需長期保存

則需放入液氮耀。

4細胞計數(shù)法

按前述細胞常規(guī)傳代方法將長滿細胞培養(yǎng)瓶底的細胞制備成單細胞懸液，計算懸液中的細胞數(shù)量時，單位尋常為細胞個數(shù)/ml，便于觀測細胞增殖和調(diào)整懸液中細胞密度。

用酒精棉球?qū)⒂嫈?shù)板及蓋玻片擦拭清白，將蓋玻片輕柔的蓋在血細胞計數(shù)板上的小室上，并將它移向一側(cè)，使其稍稍露出計數(shù)板臺面，以便于滴加細胞懸液。用吸管充分打勻離心管中的細胞懸液，之后用移液器吸取8μl細胞懸液，將懸液打入蓋玻片和計數(shù)板的交界處邊緣，打入時槍頭與計數(shù)板大約呈30°傾斜角，通過毛細管虹吸作用，細胞懸液最終充滿蓋玻片及計數(shù)板之間，靜置3min，注意蓋玻片下不能有氣泡，也不能有懸液流入旁邊槽中，否則都會嚴重影響細胞計數(shù)的確鑿度。

計數(shù)：將計數(shù)板放置于顯微鏡低倍鏡下細心觀測，調(diào)整視野后進行細胞計數(shù)。依照象限分布，順時針觀測并記錄計數(shù)板四角方格內(nèi)的細胞總數(shù)。細胞計數(shù)時需遵循原則：細胞完整才可計數(shù)，若有殘缺不可計數(shù)，若細胞存在聚集成團現(xiàn)象，則細胞數(shù)計為細胞團數(shù)。若有個別細胞位于方格邊線，計數(shù)時需遵循原則：計上邊線細胞，不計下邊線細胞；計左邊線細胞，不計右邊線細胞。

計算：計完數(shù)后，需換算出每ml懸液中的細胞數(shù)。由于計數(shù)板中每一方格的面積為0.1cm2，高為0.01cm，因此方格空間體積為0.0001cm3即0.1mm3。由于1ml=1000mm3，所以每一方格內(nèi)細胞數(shù)×104=細胞數(shù)/ml,故可按下式計算：細胞懸液細胞數(shù)/ml=4個方格總數(shù)/4×104。如計算前已稀釋，可再乘稀釋倍數(shù)。

5細胞培養(yǎng)

將細胞株置于37°C，含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，所用培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的1640雙抗培養(yǎng)液，為有效維持細胞的耐藥性，依照