真菌藥敏試驗方法比較

真菌藥敏試驗方法比較第1頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一真菌藥敏試驗臨床難以開展的原因1.按照NCCLS推薦的稀釋法,操作繁瑣2.有些藥只能用于某種菌的抗菌活性測定3.紙片法試驗未得到NCCLS認(rèn)可4.E試驗價錢太貴5.藥敏孵育時間因菌種而不同第2頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一體外敏感試驗與臨床治療相關(guān)性真菌體外藥敏試驗結(jié)果與口咽部真菌感染結(jié)果相關(guān)性好對于深部的真菌感染，抗真菌藥物敏感性試驗同臨床治療的相關(guān)性還有待進(jìn)一步證實體外敏感試驗沒有考慮到真菌對抗真菌藥物在體內(nèi)的動力學(xué)和復(fù)雜的生物學(xué)作用第3頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一真菌體外藥物敏感試驗方法

NCCLSM27-A：常量肉湯稀釋法，微量肉湯稀釋法E-test法NCCLSM44-P紙片擴(kuò)散法(僅限氟康唑)

丹麥Rosco紙片擴(kuò)散法(NCCLS未認(rèn)可)

第4頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一

真菌體外藥敏用培養(yǎng)基

常量肉湯和微量肉湯法RPMI1640液制備：

RPMI 10.4g

MOPS（三氮嗎啡啉丙磺酸） 34.53g 蒸餾水900ml溶解后，用1MNaOH調(diào)節(jié)PH至7.0（25℃），用蒸餾水溶至1000ml，高壓滅菌后，冷卻至50℃加入RPMI1640用0.22μm濾膜抽濾除菌，4℃保存。

第5頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一真菌體外藥敏用培養(yǎng)基

E-test法：

在RPMI液體培養(yǎng)基中補(bǔ)充葡萄糖，使其終濃度為2%。NCCLS紙片擴(kuò)散法：

Mueller-Hinton瓊脂補(bǔ)充2%葡萄糖和0.5μg/ml美藍(lán)丹麥ROSCO紙片擴(kuò)散法：

改良的SHADOMY（PH7.0）培養(yǎng)基主要成分：酵母粉，葡萄糖，天冬氨酸，磷酸緩沖液等。第6頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一菌液制備將受試菌在沙保羅培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)種，以保證其純度和活性。用0.85%的鹽水制成酵母菌懸液，調(diào)整其濁度達(dá)到0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)（約為1~5×106CFU/ml）。常量稀釋法：用RPMI1640液體稀釋2000倍 接種濃度約為0.5~2.5×103CFU/ml

微量稀釋法：用RPMI1640液體稀釋1000倍接種濃度約為1～5×103CFU/mlE-test法和NCCLS紙片擴(kuò)散法：用菌液濁度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?。Rosco紙片擴(kuò)散法：1.念珠菌： 0.5麥?zhǔn)蠞岫龋睇}水1：10稀(1~5×105CFU/ml)2.隱球菌屬： 1.0麥?zhǔn)蠞岫?.其它酵母菌：0.5麥?zhǔn)蠞岫?，生理鹽水1：1稀釋第7頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一常量肉湯法(M27-A)先將氟康唑粉末溶于蒸餾水，然后用配制好的RPMI1640液倍比稀釋，使其起始濃度為640μg/ml,終末濃度為1.25μg/ml，分裝無菌潔凈的12mm×75mm試管：

64321684210.5.25.125＋－前10管：0.2ml氟康唑＋1.8ml菌液念珠菌屬35

℃孵育48小時新型隱球菌72小時讀取MIC結(jié)果2ml菌液1.8ml1640第8頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一常量稀釋法

藥敏結(jié)果判定

氟康唑，伊曲康唑，兩性霉素為100%抑制其他唑類藥物為80%抑制（取0.2ml的生長對照菌液加入0.8mlRPMI液體培養(yǎng)基的菌液濃度）質(zhì)控株克柔念珠菌ATCC6258

近平滑念珠菌ATCC22019

白念珠菌ATCC90028

白念珠菌ATCC24433

第9頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一微量肉湯法

氟康唑的稀釋方法同常量法，但起始濃度為2×常量法的濃度（即128μg/ml），終濃度為0.25μg/ml。

。37℃。37℃6432168421.5.25.125＋－氟康唑：1-10孔分別為100ul菌懸液：1-10孔分別為100ul200ulRPMI湯200ul菌懸液

35℃ 新型隱球菌72小時，其余菌株48小時讀取MIC結(jié)果第10頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一酵母菌的NCCLSM27-A各藥物折點(diǎn)

粘膜及系統(tǒng)性感染：氟康唑（除克柔念珠菌）敏感： ≤8μg/ml

中介： －耐藥： ≥64μg/ml粘膜感染：伊曲康唑敏感： ≤0.125μg/ml

中介： －耐藥： ≥1μg/ml粘膜及系統(tǒng)性感染：5-氟嘧啶敏感： ≤4μg/ml

中介： 8~16μg/ml

耐藥： ≥32μg/ml第11頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一酵母菌E-test法

瑞典ABBiodisk

優(yōu)點(diǎn)：有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性

MIC第12頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一E-test法

0.5麥?zhǔn)媳葷嵋海s為1~5×106CFU/ml）。菌懸液均勻涂布于藥敏板上

35℃培養(yǎng)24小時讀取結(jié)果

光滑念珠菌新型隱球菌等生長較慢的菌種需適當(dāng)延長培養(yǎng)時間。第13頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一E-test法評價

準(zhǔn)確性高,且操作簡便E-test法得到的MIC值在某些菌種中要低于NCCLS推薦的常量肉湯稀釋法測得的MIC20%濃度CO2的環(huán)境中，可使此方法的結(jié)果更真實反映藥物對致病菌的敏感性缺點(diǎn)：1.價格太高每片40-50元2.吡咯類MIC終點(diǎn)不好確定第14頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一酵母菌紙片擴(kuò)散法敏感試驗

NCCLSM44-P.2003

培養(yǎng)基：Mueller-Hinton瓊脂補(bǔ)充2％Glucose

0.5ug/mlMethylenebluedyePH7.2-7.4優(yōu)點(diǎn)：有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性 操作簡便，價廉缺點(diǎn)：目前只限氟康唑

第15頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一NCCLS紙片擴(kuò)散法

0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)（約為1~5×106CFU/ml）。菌懸液均勻涂布于藥敏板上步驟同細(xì)菌敏感試驗操作一致，35～37℃孵育18～24小時，對于生長緩慢的菌株如新型隱球菌，菌液需調(diào)至1麥?zhǔn)蠁挝?，孵?8小時，光滑念珠菌也需孵育48小時讀取抑菌環(huán)直徑。第16頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一酵母菌紙片擴(kuò)散法敏感試驗

NCCLS

M44-P.2003

氟康唑解釋標(biāo)準(zhǔn)和相應(yīng)的最小抑菌濃度

抑菌環(huán)直徑（mm)

MIC（ug/ml)敏感（S)>=19<=8劑量依賴性敏感（SDD)15-1816-32耐藥（R)<=14>=64S＝SusceptibleSDD=Susceptible－DoseDependentR=Resistant

第17頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一酵母菌紙片擴(kuò)散法敏感試驗NCCLSM44-P.2003氟康唑?qū)?biāo)準(zhǔn)菌株24h抑菌環(huán)直徑（mm)的質(zhì)控允許范圍標(biāo)準(zhǔn)菌株 氟康唑25ug 沃爾康唑1ug白念珠菌ATCC90028 28-39 31-42 近平滑念珠菌ATCC22019 22-33 28-37

熱帶念珠菌ATCC750 26-37 －克柔念珠菌 ATCC6258 － 16-25

第18頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一ROSCO紙片擴(kuò)散法

ROSCO紙片擴(kuò)散法：1.克柔念珠菌： 0.5麥?zhǔn)蠞岫?，生理鹽水1：10稀釋 菌液為5×105CFU/ml2.隱球菌屬： 1麥?zhǔn)蠞岫?.其它酵母菌：0.5麥?zhǔn)蠞岫龋睇}水1：1稀釋 菌液為2.5×106CFU/ml將稀釋好的菌液涂布在改良的SHADOMY（PH7.0）培養(yǎng)基上其它操作同細(xì)菌。第19頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一

讀取抑菌環(huán)直徑近似到mm在大約80%抑制區(qū)為測量邊界在抑菌環(huán)內(nèi)個別細(xì)小或中等大小的菌落，<15可忽略不計Rosco紙片擴(kuò)散法藥敏結(jié)果判定第20頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一兩種紙片擴(kuò)散法的比較Rosco紙片擴(kuò)散法檢測菌種念珠菌屬，隱球菌屬培養(yǎng)基改良SHADOMY瓊脂，PH7.0試驗藥品及劑量AMB10μg，IT8μg，F(xiàn)LA15μg，F(xiàn)C1，10μg，F(xiàn)C10μg，KET15μg等接種的菌量：5×105CFU/ml（克柔念珠菌先制成0.5麥?zhǔn)蠞岫?，再用生理鹽水1：10。隱球菌屬配1.0麥?zhǔn)喜幌♂專┢渌N配0.5麥?zhǔn)蠞岫龋?：1稀釋培養(yǎng)條件念珠菌屬35℃培養(yǎng)18~24小時，新型隱球菌30℃培養(yǎng)42~48小時結(jié)果判讀FC及AMB100%被抑制唑類藥物80%抑制質(zhì)控株光滑念珠菌2238NL

白念珠菌ATCC64548 白念珠菌ATCC64550NCCLS紙片擴(kuò)散法

檢測菌種念珠菌屬，隱球菌屬培養(yǎng)基Mueller-Hinton瓊脂中補(bǔ)充2%的葡萄糖和0.5μg/ml的美藍(lán)試驗藥品及劑量FLA25μg接種的菌量1～5×106/mL隱球菌1.0麥?zhǔn)蠞岫扰囵B(yǎng)條件35

℃孵育18～24小時新型隱球菌培養(yǎng)42~48小時結(jié)果判讀FC及AMB100%被抑制，唑類藥物80%抑制質(zhì)控株白念珠菌ATCC90028近平滑念珠菌ATCC22019

第21頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一Rosco紙片擴(kuò)散法各藥物折點(diǎn)粘膜酵母菌感染氟康唑，克霉唑，酮康唑，氟胞嘧啶1ug，特比奈吩，咪康唑等敏感：≥20mm 中介：12~19mm