熒光定量PCR原理及應(yīng)用

熒光定量PCR原理及應(yīng)用第1頁，共23頁，2023年，2月20日，星期二實時熒光定量PCR的基本原理

實時熒光定量PCR就是通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。第2頁，共23頁，2023年，2月20日，星期二在實時熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖.第3頁，共23頁，2023年，2月20日，星期二熒光擴(kuò)增曲線分為三個階段：熒光背景信號階段、熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。第4頁，共23頁，2023年，2月20日，星期二熒光背景信號階段：為擴(kuò)增最初的10～15個循環(huán)，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。平臺期：擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始DNA拷貝數(shù)。第5頁，共23頁，2023年，2月20日，星期二指數(shù)期：此期PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，因此我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和CT值。第6頁，共23頁，2023年，2月20日，星期二熒光閾值：是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。CT值：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值。第7頁，共23頁，2023年，2月20日，星期二CT值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，到達(dá)熒光閾值的CT值越小，反之越大。第8頁，共23頁，2023年，2月20日，星期二利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中縱坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，橫坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。第9頁，共23頁，2023年，2月20日，星期二

定量方法絕對定量：是用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相同的條件下目的基因測得的熒光信號量同標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而得到目的基因的量。第10頁，共23頁，2023年，2月20日，星期二相對定量：是通過與內(nèi)參基因Ct值之間的相差來計算表達(dá)基因的差異，也稱之為2-ΔΔCt。第11頁，共23頁，2023年，2月20日，星期二

其他定量方法第12頁，共23頁，2023年，2月20日，星期二

熒光定量PCR檢測模式熒光定量PCR的理論基礎(chǔ)：均基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)的原理，即當(dāng)一個熒光基團(tuán)與一個淬滅基團(tuán)的距離鄰近時（＜10nm)，就會發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移，淬滅基團(tuán)會吸收熒光基團(tuán)在激發(fā)光作用下的激發(fā)熒光，從而使其發(fā)不出熒光。但如果熒光基團(tuán)一旦與淬滅基團(tuán)分開，淬滅作用即消失。第13頁，共23頁，2023年，2月20日，星期二檢測模式SYBRGreenI檢測模式：SYBRGreenI是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA結(jié)合染料。與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。第14頁，共23頁，2023年，2月20日，星期二在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBRGreenI工作原理第15頁，共23頁，2023年，2月20日，星期二缺點：PCR反應(yīng)中的非特異性擴(kuò)增或引物二聚體也會產(chǎn)生熒光，通常本底較高，引起假陽性。優(yōu)點：通用性好，價格低，在科研中使用較普遍。第16頁，共23頁，2023年，2月20日，星期二水解探針模式（Taqman）TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的5’末端，而淬滅劑則在3’末端。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對時，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時，聚合酶的5’外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離，發(fā)射熒光。第17頁，共23頁，2023年，2月20日，星期二一分子的產(chǎn)物生成就伴隨著一分子熒光信號的產(chǎn)生，隨著循環(huán)數(shù)增加，熒光信號不斷積累。第18頁，共23頁，2023年，2月20日，星期二分子信標(biāo)探針模式分子信標(biāo)是一種在靶DNA不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記寡核苷酸探針。分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為15-30個核苷酸長，并與目標(biāo)序列互補(bǔ)；莖一般5-7個核苷酸長，并相互配對形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團(tuán)連接在莖臂的一端，而淬滅劑則連接于另一端。第19頁，共23頁，2023年，2月20日，星期二模板不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)緊緊靠近而被淬滅。當(dāng)存在模板時，環(huán)序列將與模板配對，此時分子信標(biāo)成鏈狀而非莖環(huán)狀，熒光基團(tuán)與淬滅劑分開，使得熒光基團(tuán)發(fā)出熒光。第20頁，共23頁，2023年，2月20日，星期二其它還有雙雜交探針、蝎形探針、LUXPrimers等模式。第21頁，共23頁，2023年，2月20日，星期二

引物設(shè)計原則引物最適長度為15～20bp.G+C含量為40～60%。引物的Tm值應(yīng)相似，差異不超過1～2℃.產(chǎn)物長度在80～150bp.不能形成引物二聚體。第22頁，共23頁，2