生物化學(xué)與新生物技術(shù)

生物化學(xué)與新生物技術(shù)第1頁(yè)/共59頁(yè)基因組genome基因組是生物體內(nèi)全部遺傳信息的集合一個(gè)物種單倍體的一套染色體DNA第2頁(yè)/共59頁(yè)幾個(gè)代表物種的基因組大小第3頁(yè)/共59頁(yè)第4頁(yè)/共59頁(yè)基因組學(xué)genomics發(fā)展和應(yīng)用DNA制圖、測(cè)序新技術(shù)以及計(jì)算機(jī)程序，研究生命體（包括人類(lèi)）全部基因組結(jié)構(gòu)及功能的學(xué)科第5頁(yè)/共59頁(yè)基因組學(xué)研究的最終目標(biāo)

獲得生物體全部基因組序列鑒定所有基因的功能明確基因之間的相互作用關(guān)系闡明基因組的進(jìn)化規(guī)律

第6頁(yè)/共59頁(yè)人類(lèi)基因組計(jì)劃的科學(xué)意義在于：（1）確定人類(lèi)基因組中約5萬(wàn)個(gè)編碼基因的序列及其在基因組中的物理位置，研究基因的產(chǎn)物及其功能。

（2）了解轉(zhuǎn)錄和剪接調(diào)控元件的結(jié)構(gòu)與位置，從整個(gè)基因組結(jié)構(gòu)的宏觀(guān)水平上理解基因轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。

（3）從整體上了解染色體結(jié)構(gòu)，包括各種重復(fù)序列以及非轉(zhuǎn)錄“框架序列”的大小和組織，了解各種不同序列在形成染色體結(jié)構(gòu)、DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)調(diào)控中的影響與作用。

（4）研究空間結(jié)構(gòu)對(duì)基因調(diào)節(jié)的作用。有些基因的表達(dá)調(diào)控序列與被調(diào)節(jié)基因從直線(xiàn)距離上看，似乎相距甚遠(yuǎn)，但若從整個(gè)染色體的空間結(jié)構(gòu)上看則恰恰處于最佳的調(diào)節(jié)位置，因此，有必要從三維空間的角度來(lái)研究真核基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律。第7頁(yè)/共59頁(yè)（5）發(fā)現(xiàn)與DNA復(fù)制、重組等有關(guān)的序列。DNA的忠實(shí)復(fù)制保障了遺傳的穩(wěn)定性，正常的重組提供了變異與進(jìn)化的分子基礎(chǔ)。局部DNA的推遲復(fù)制、異常重組等現(xiàn)象則導(dǎo)致疾病或者胚胎不能正常發(fā)育，因此，了解與人類(lèi)DNA正常復(fù)制和重組有關(guān)的序列及其變化，將對(duì)研究人類(lèi)基因組的遺傳與進(jìn)化提供重要的結(jié)構(gòu)上的依據(jù)。（6）研究DNA突變、重排和染色體斷裂等，了解疾病的分子機(jī)制，包括遺傳性疾病、易感性疾病、放射性疾病甚至感染性疾病引發(fā)的分子病理學(xué)改變及其進(jìn)程，為這些疾病的診斷、預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

（7）確定人類(lèi)基因組中轉(zhuǎn)座子、逆轉(zhuǎn)座子和病毒殘余序列，研究其周?chē)蛄械男再|(zhì)。了解有關(guān)病毒基因組侵染人類(lèi)基因組后的影響，可能指導(dǎo)人類(lèi)有效地利用病毒載體進(jìn)行基因治療。

（8）研究染色體和個(gè)體之間的多態(tài)性。這些知識(shí)可被廣泛用于基因診斷、個(gè)體識(shí)別、親子鑒定、組織配型、發(fā)育進(jìn)化等許多醫(yī)療、司法和人類(lèi)學(xué)的研究。此外，這些遺傳信息還有助于研究人類(lèi)歷史進(jìn)程、人類(lèi)在地球上的分布與遷移以及人類(lèi)與其他物種之間的比較。第8頁(yè)/共59頁(yè)HistoryoftheHumanGenomeProject1990OfficialstartofHGPwith3billion$anda15yearhorizon.1999SangerCentrepublisheschromosome222001DraftGenomepublished:Celera&Public2003Completion(almost)ofHumanGenomeCelera:CraigVenterIntl.Cons:FrancisCollins第9頁(yè)/共59頁(yè)第10頁(yè)/共59頁(yè)人類(lèi)基因組計(jì)劃HGP第11頁(yè)/共59頁(yè)所有的標(biāo)記都必須具有多態(tài)性由于不能對(duì)人類(lèi)進(jìn)行“選擇性”婚配，而且人類(lèi)子代個(gè)體數(shù)量有限、世代壽命較長(zhǎng)，呈共顯多態(tài)性的蛋白質(zhì)數(shù)量不多，等位基因的數(shù)量不多。形態(tài)標(biāo)記細(xì)胞學(xué)標(biāo)記生化標(biāo)記DNA分子標(biāo)記遺傳標(biāo)記第12頁(yè)/共59頁(yè)第13頁(yè)/共59頁(yè)物理圖物理圖是指以已知核苷酸序列的DNA片段為“路標(biāo)”，以堿基對(duì)（bp，kb，Mb）作為基本測(cè)量單位（圖距）的基因組圖。

酵母第三號(hào)染色體遺傳圖（右）和物理圖（左）的比較第14頁(yè)/共59頁(yè)策略用機(jī)器進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序，一次可讀400－800個(gè)堿基，由于測(cè)定的序列長(zhǎng)度有一定限制?？寺≈丿B群法鳥(niǎo)槍法第15頁(yè)/共59頁(yè)克隆重疊群法

將基因組DNA切割長(zhǎng)度為0.1Mb－1Mb的大片段，克隆到Y(jié)AC或BAC載體上然后再進(jìn)行亞克隆，分別測(cè)定單個(gè)亞克隆的序列再裝配、連接成連續(xù)的DNA分子。這是一種自上而下（uptodown）的測(cè)序策略

clone-by-clonemethod第16頁(yè)/共59頁(yè)鳥(niǎo)槍法將較長(zhǎng)的基因片段打斷，構(gòu)建一系列的隨機(jī)亞克隆，然后測(cè)定每個(gè)亞克隆的序列，用計(jì)算機(jī)分析以發(fā)現(xiàn)重疊區(qū)域，最終對(duì)大片段的DNA定序。第17頁(yè)/共59頁(yè)第18頁(yè)/共59頁(yè)測(cè)序技術(shù)Sanger雙脫氧鏈終止法Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法高通量測(cè)序技術(shù)第19頁(yè)/共59頁(yè)高通量DNA序列分析技術(shù)

人類(lèi)基因組計(jì)劃的成功很大程度上得益于有效減少DNA測(cè)序成本的技術(shù)更新。通過(guò)改良測(cè)序方法，不斷提升其自動(dòng)化程度，DNA測(cè)序的成本降低了100倍，從20世紀(jì)70-80年代$10/bp降低到本世紀(jì)初$0.1/bp！如果一個(gè)熟練的DNA序列分析人員采取早期80年代方法每天測(cè)定1000bp計(jì)算，人類(lèi)基因組（約3×109bp）的全序列分析，至少也得需要100名這樣的工人花上100年的時(shí)間才能完成。而2000年代的高通量測(cè)序儀可達(dá)到月測(cè)序1-6Mbp！第20頁(yè)/共59頁(yè)第二代測(cè)序技術(shù)?“NextGeneration”

–Roche454：Pyrosequencing –Solexa/Illumina：cyclicalbaseaddition –ABISOLiD：sequencingbyligation第21頁(yè)/共59頁(yè)Illumina/SolexaGenomeAnalyzer2000Mb/runAppliedBiosystemsABI3730XL1Mb/dayRoche/454GenomeSequencerFLX100Mb/runAppliedBiosystemsSOLiD3000Mb/run第22頁(yè)/共59頁(yè)第23頁(yè)/共59頁(yè)功能基因組學(xué)

在完成一個(gè)生物體全部基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，詳盡分析基因組的序列，鑒定基因組全部基因的功能，描述各個(gè)基因的表達(dá)和調(diào)控模式。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究某一特殊功能狀態(tài)的細(xì)胞全套R(shí)NA的類(lèi)型與拷貝數(shù)；比較不同功能狀態(tài)下RNA表達(dá)的變化，搜尋與功能狀態(tài)變化緊密相關(guān)的重要基因群。此研究領(lǐng)域的常用技術(shù)是生物芯片技術(shù)。

蛋白質(zhì)組學(xué)指蛋白質(zhì)組研究領(lǐng)域，即研究某一特定狀態(tài)的細(xì)胞全套蛋白質(zhì)表達(dá)譜。此研究領(lǐng)域常用技術(shù)有蛋白質(zhì)雙向電泳、飛行質(zhì)譜、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)等。第24頁(yè)/共59頁(yè)轉(zhuǎn)錄組指一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的一套R(shí)NA轉(zhuǎn)錄物，包含了某一環(huán)境條件、某一生命階段、某一生理或病理（功能）狀態(tài)下，生命體的細(xì)胞或組織所表達(dá)的基因種類(lèi)和水平。mRNA小RNA：miRNA、siRNA蛋白質(zhì)組指一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的全套蛋白質(zhì)，即研究某一特定狀態(tài)的細(xì)胞全套蛋白質(zhì)表達(dá)譜。此研究領(lǐng)域常用技術(shù)有蛋白質(zhì)雙向電泳、飛行質(zhì)譜、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)等。與基因組不同的是，轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組的定義中包含了時(shí)間和空間的限定。第25頁(yè)/共59頁(yè)轉(zhuǎn)錄組學(xué)基本研究方法Real-timePCR基于雜交的轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法基因芯片基于測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法EST全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)SAGE第二代測(cè)序技術(shù)生物信息學(xué)分析：基因表達(dá)聚類(lèi)第26頁(yè)/共59頁(yè)生物芯片在載體材料上，以大規(guī)模陣列的形式排布了不同的蛋白質(zhì)或核酸等生物分子，形成可與目的靶分子相互作用，并進(jìn)行反應(yīng)的固相表面。第27頁(yè)/共59頁(yè)DNA芯片通過(guò)微陣列(Microarray)技術(shù)將高密度DNA片段陣列通過(guò)高速機(jī)器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在固相表面，以熒光標(biāo)記的DNA探針，借助堿基互補(bǔ)雜交原理，進(jìn)行大量的DNA檢測(cè)基因組芯片表達(dá)芯片第28頁(yè)/共59頁(yè)芯片載體玻璃片、硅片、尼龍膜、凝膠、金屬對(duì)載體進(jìn)行化學(xué)修飾，活化試劑通過(guò)化學(xué)反應(yīng)在載體表面鍵合上活性基團(tuán)，以便與配基結(jié)合，形成具有生物活性的親和表面，用于固定蛋白質(zhì)和核酸活化試劑：EDC、NHS活性基團(tuán)：氨基、環(huán)氧化物、巰基、醛基第29頁(yè)/共59頁(yè)基因芯片的探針寡核苷酸OligocDNA：PCR產(chǎn)物

第30頁(yè)/共59頁(yè)SpottedMicroarrayscDNAArraysOligoArrays

InSituOligoSynthesisPhotosynthesisPlanersurfaceMicrofluidicschipE-fieldsynthesisIntegratedChips

IntegrateduF,microarrayanddetectionchipswithPCR,fluorescenceore-detectionMicrofluidicsPlasticsCeramicsSiliconOthermaterials不同的生物芯片技術(shù)平臺(tái)點(diǎn)樣芯片原位合成芯片微流體芯片整合型芯片第31頁(yè)/共59頁(yè)點(diǎn)樣芯片非接觸式接觸式預(yù)先合成好的探針通過(guò)類(lèi)似于噴墨打印機(jī)的技術(shù)噴射到玻璃基片表面，或者用針頭點(diǎn)在片基上。

第32頁(yè)/共59頁(yè)原位合成激光照排技術(shù)光源遮蔽板芯片第33頁(yè)/共59頁(yè)arrayprobesA3×3arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotideDepositionSequenceACGAMask1AAAAA探針合成第34頁(yè)/共59頁(yè)arrayprobesA3×3arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotideDepositionSequenceACGC

Mask2CCCCCCAAAAA探針合成第35頁(yè)/共59頁(yè)A3×3arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotideDepositionSequenceACGGMask3CCCCCCAAAAAGGGGGGCGACGACGAGCGAGCAC探針合成完成的芯片第36頁(yè)/共59頁(yè)LTLLLCLLLLLLLLACTTTACCCCCCGCCGATATCATCATCGACGAACTACTAGCAGCTTOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPLTLLLCLLLLLLLLACTTTACCCCCCGCCGATATCATCATCGACGAACTACTAGCAGCTTOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPLTLLLCLLLLLLLLACTTTACCCCCCGCCGATATCATCATCGACGAACTACTAGCAGCTTOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPForgrowthstep:onetypeofmonomeriscoupledtospecificsitesdeprotectedusingPGA.Computergeneratedlightirradiationpatterns第37頁(yè)/共59頁(yè)樣本的處理方法按照樣本分

DNA、RNA、DNA-蛋白復(fù)合體按照標(biāo)記信號(hào)分子劃分

熒光染料、生物素、放射性元素按照標(biāo)記方法分

cDNA直接標(biāo)記(間接標(biāo)記)、PCR擴(kuò)增標(biāo)記、末端標(biāo)記第38頁(yè)/共59頁(yè)芯片實(shí)驗(yàn)流程1、分離RNA（10μg）2、標(biāo)記3、雜交（預(yù)雜交）4、洗片5、掃描6、數(shù)據(jù)分析第39頁(yè)/共59頁(yè)TaggedRNAfragmentsflushedoverarrayLaseractivationoffluorescenttagsOpticalscanningofhybridizationintensities基因芯片的雜交實(shí)驗(yàn)第40頁(yè)/共59頁(yè)圖像掃描Cy5Cy3第41頁(yè)/共59頁(yè)差異基因篩選原理：采用cy3/cy5的ratio值對(duì)差異基因進(jìn)行判斷，或采用統(tǒng)計(jì)方法對(duì)差異基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷。倍數(shù)法：cy3/cy5比值大于2或者小于0.5第42頁(yè)/共59頁(yè)基因芯片的應(yīng)用基因表達(dá)譜分析基因發(fā)現(xiàn)SNP檢測(cè)藥物基因組學(xué)微生物菌種鑒定預(yù)防醫(yī)學(xué)研究第43頁(yè)/共59頁(yè)RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（全轉(zhuǎn)錄組鳥(niǎo)槍法測(cè)序）：利用深度測(cè)序技術(shù)對(duì)各種類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行高通量檢測(cè)，獲得RNA片段在特定樣本中的含量第44頁(yè)/共59頁(yè)定量化可以直接測(cè)定每個(gè)轉(zhuǎn)錄本片段序列、單核苷酸分辨率的準(zhǔn)確度，同時(shí)不存在傳統(tǒng)微陣列雜交的熒光模擬信號(hào)帶來(lái)的交叉反應(yīng)和背景噪音問(wèn)題靈敏度高，可以檢測(cè)細(xì)胞中少至幾個(gè)拷貝的稀有轉(zhuǎn)錄本可以對(duì)任意物種進(jìn)行全基因組分析，無(wú)需預(yù)先設(shè)計(jì)特異性探針，因此無(wú)需了解物種基因信息，能夠直接對(duì)任何物種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，同時(shí)能夠檢測(cè)未知基因，發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本第45頁(yè)/共59頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組：一個(gè)細(xì)胞（或組織、機(jī)體）所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)組學(xué)：以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，研究細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的科學(xué)本質(zhì)是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)特征：表達(dá)水平（量）翻譯后的修飾（成熟與調(diào)控）蛋白與蛋白相互作用（信號(hào)通路）等由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細(xì)胞代謝等過(guò)程的整體而全面的認(rèn)識(shí)第46頁(yè)/共59頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)研究范疇蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)間相互作用蛋白質(zhì)和核酸之間相互作用蛋白質(zhì)及其組成質(zhì)點(diǎn)的分離、分析、鑒定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析生理、病理或不同發(fā)育狀態(tài)下蛋白質(zhì)組表達(dá)差異蛋白質(zhì)信息庫(kù)第47頁(yè)/共59頁(yè)研究策略與技術(shù)兩條互補(bǔ)的實(shí)驗(yàn)流程基于凝膠的工作流程基于液相色譜的工作流程

第48頁(yè)/共59頁(yè)雙向電泳（2D）第49頁(yè)/共59頁(yè)是等電聚焦電泳和SDS的組合即先進(jìn)行等電聚焦電泳（按照pI分離）然后再進(jìn)行SDS（按照分子大小）凝膠經(jīng)染色得到二維分布的蛋白質(zhì)圖

第50頁(yè)/共59頁(yè)第一向IPG-IEF電泳固相pH梯度等電聚焦（immobilizedpHgradientsisoelectricfocusing）IEF是一種根據(jù)樣品的等電點(diǎn)不同而使它們?cè)趐H梯度中相互分離的一種電泳技術(shù)將等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場(chǎng)內(nèi)經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，各組分將分別聚焦在各自等電點(diǎn)相應(yīng)的pH位置上，形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶第51頁(yè)/共59頁(yè)第二向垂直SDS電泳SDS-PAGE：十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis）聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。SDS與蛋白質(zhì)形成雪茄狀帶負(fù)電荷復(fù)合物，從而消除了蛋白間的電荷及形狀差異，電泳速度僅與分子量有關(guān)垂直電泳第52頁(yè)/共59