微生物的菌種選育課件

工業(yè)微生物5.微生物的菌種選育理想發(fā)酵工業(yè)用菌要求1、遺傳性狀穩(wěn)定；2、生長速度快，不易被噬菌體等異種微生物污染；3、目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量盡可能接近理想轉(zhuǎn)化率；4、最好是胞外產(chǎn)物；5、盡可能減少產(chǎn)物類似物的生成；6、培養(yǎng)基簡單、來源廣、價(jià)格低；7、對T、pH、離子強(qiáng)度、剪切力不敏感；8、溶氧要求低、便于培養(yǎng)能耗低；純種分離(1)稀釋法(2)劃線法(3)組織分離原種斜面篩選(1)紙片培養(yǎng)顯色法(2)透明圈法(3)變色圈法(4)生長圈法(5)抑菌圈法復(fù)篩再復(fù)篩3－5株性能鑒定發(fā)酵pH、T、通風(fēng)、攪拌、無菌程度、適應(yīng)性、副產(chǎn)品和對低劣廉價(jià)原料的利用毒性實(shí)驗(yàn)菌種鑒定5.2基因突變和微生物菌種選育一、3個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)

（一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化試驗(yàn)最早進(jìn)行轉(zhuǎn)化（transformation）實(shí)驗(yàn)的是F.Griffith（1928年），他以Streptococcuspneumoniae（肺炎鏈球菌，舊稱“肺炎雙球菌”）作為研究對象。5.2.1遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)（2）細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)（3）S型菌的無細(xì)胞抽提液試驗(yàn)（1）從活的S菌中抽提各種細(xì)胞成分（DNA，蛋白質(zhì)，莢膜多糖等）（2）對各組分進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)只有DNA被酶降解破壞的抽提物無轉(zhuǎn)化活性DNA是轉(zhuǎn)化所必需的轉(zhuǎn)化因子（二）噬菌體感染實(shí)驗(yàn)1952年，A.D.Hershey和M.Chase發(fā)表了證明DNA是噬菌體的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的著名實(shí)驗(yàn)——噬菌體感染實(shí)驗(yàn)在DNA中存在著包括合成蛋白質(zhì)外殼在內(nèi)的整套遺傳信息。（三）植物病毒的重建實(shí)驗(yàn)為了證明核酸是遺傳物質(zhì)，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的煙草花葉病毒（TMV）進(jìn)行了著名的植物病毒重建實(shí)驗(yàn)。煙草花葉病毒的核酸抗血清處理，證明雜種病毒的蛋白質(zhì)外殼來自病毒1，而非病毒2雜種病毒的后代的蛋白質(zhì)外殼表現(xiàn)為病毒2，而非病毒1遺傳物質(zhì)是核酸（RNA）而非蛋白質(zhì)霍氏車前病毒的蛋白質(zhì)外殼HRVHMV思考1）蛋白質(zhì)是否可以作為遺傳物質(zhì)？

prion是生命的一個(gè)特例？還是僅僅為表達(dá)調(diào)控的一種形式？2）蛋白質(zhì)折疊與功能的關(guān)系，是否存在折疊密碼？DNA→RNA→肽鏈→蛋白質(zhì)三、原核微生物的質(zhì)粒

1.定義和特點(diǎn)質(zhì)粒：一種獨(dú)立于染色體外，能進(jìn)行自主復(fù)制的細(xì)胞質(zhì)遺傳因子，主要存在于各種微生物細(xì)胞中。cccDNAocDNAlDNA通常以共價(jià)閉合環(huán)狀（covalentlyclosedcircle，簡稱CCC）的超螺旋雙鏈DNA分子存在于細(xì)胞中；也發(fā)現(xiàn)有線型雙鏈DNA質(zhì)粒和RNA質(zhì)粒；質(zhì)粒分子的大小范圍從1kb左右到1000kb；（細(xì)菌質(zhì)粒多在10kb以內(nèi)）2.質(zhì)粒的分子結(jié)構(gòu)提取所有胞內(nèi)DNA后電鏡觀察；超速離心或瓊脂糖凝膠電泳后觀察；對于實(shí)驗(yàn)室常用菌，可用質(zhì)粒所帶的某些特點(diǎn)，如抗藥性初步判斷。特定的質(zhì)粒提取方法和后處理使染色體和RNA均被除掉。3.質(zhì)粒的檢測（1）F質(zhì)粒（Fplasmid）

又稱F因子、致育因子（fertilityfactor）或性因子（sexfactor），其大小約100kb，為cccDNA，這是最早發(fā)現(xiàn)的一種與大腸桿菌的有性生殖現(xiàn)象（接合作用）有關(guān)的質(zhì)粒。攜帶F質(zhì)粒的菌株稱為F+菌株（相當(dāng)于雄性），無F質(zhì)粒的菌株稱為F-菌株（相當(dāng)于雌性）。（2）R質(zhì)粒（Rplasmid）包括抗藥性和抗重金屬二大類。又稱R因子（Rfactor）、抗性因子（resisitranceplasmid）。含調(diào)節(jié)DNA復(fù)制和拷貝數(shù)的基因以及轉(zhuǎn)移基因，相對分子量約11×107，具有轉(zhuǎn)移功能；抗性轉(zhuǎn)移因子（resistancetransferfactor，RTF）抗性決定因子（r-determinant）大小不很固定，相對分子量從幾百萬至11×108以上，無轉(zhuǎn)移功能，含各種抗性基因，如抗青霉素、氨芐青霉素、氯霉素、鏈霉素、卡那霉素和磺胺等基因。R質(zhì)粒一般由兩個(gè)相連的DNA片段組成由RTF和r決定子結(jié)合而形成R質(zhì)粒的過程：抗性質(zhì)粒在細(xì)菌間的傳遞是細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一。R100質(zhì)粒（89kb）可使宿主對下列藥物及重金屬具有抗性：汞（mercuricion，mer）四環(huán)素（tetracycline，tet）鏈霉素（Streptomycin,Str）、磺胺（Sulfonamide,Su）、氯霉素（Chlorampenicol,Cm）夫西地酸（fusidicacid，fus）并且負(fù)責(zé)這些抗性的基因是成簇地存在于抗性質(zhì)粒上。R質(zhì)粒的種類很多，例如，R1（94kb）和R100（89.3kb）等。（3）Col質(zhì)粒（colicinplasmid，colplasmid）又稱大腸桿菌素質(zhì)?；虍a(chǎn)大腸桿菌素因子（colicinogenicfactor，colfactor）。細(xì)菌素（bacteriocin）是質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)，一般由細(xì)菌產(chǎn)生，可抑制或殺死其他近緣細(xì)菌或同種不同菌株的代謝產(chǎn)物，但不具有很廣的殺菌譜。細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因、涉及細(xì)菌素運(yùn)輸及發(fā)揮作用（processing）的蛋白質(zhì)的基因、賦予宿主對該細(xì)菌素具有“免疫力”的相關(guān)產(chǎn)物的基因一般都位于質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上，細(xì)菌素可以殺死同種但不攜帶該質(zhì)粒的菌株。細(xì)菌素一般根據(jù)產(chǎn)生菌的種類進(jìn)行命名：大腸桿菌（E.coli）產(chǎn)生的細(xì)菌素為colicins（大腸桿菌素），而質(zhì)粒被稱為Col質(zhì)粒。ColE1質(zhì)粒：相對分子量小（9kb，約5×106），無接合作用，是松弛性控制、多拷貝的；ColⅠb質(zhì)粒：相對分子量大（94kb，約8×107），具有通過接合而轉(zhuǎn)移的功能，屬嚴(yán)緊型控制，只有1～2個(gè)拷貝。（4）Ti質(zhì)粒（tumorinducingplasmid）即誘癌質(zhì)粒或冠癭質(zhì)粒（crowngallplasmid）。Ti質(zhì)粒是一種200kb的環(huán)狀質(zhì)粒，包括毒性區(qū)（vir）、接合轉(zhuǎn)移（con）、復(fù)制起始區(qū)（ori）和T-DNA區(qū)4部分。T-DNA區(qū)可攜帶任何外源基因整合到植物基因組中，Ti質(zhì)粒是植物基因工程中使用最廣、效果最佳的克隆載體。Agrobacteriumtumefaciens（根癌土壤桿菌或根癌農(nóng)桿菌）釋放出的Ti質(zhì)粒上的T-DNA片斷與植物細(xì)胞的核基因組整合，合成冠癭堿類（opines）,破壞控制細(xì)胞分裂的激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)，使之變成癌細(xì)胞。（5）Ri質(zhì)粒（rootinducingplasmid）

250kb的Ri質(zhì)粒中的一段T-DNA整合到宿主根部細(xì)胞的核基因組中，可發(fā)生轉(zhuǎn)化。Agrobacteriumrhizogenes（發(fā)根土壤桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌）可侵染雙子葉植物的根部，并誘發(fā)大量稱為毛狀根的不定根。Ri質(zhì)粒是外源基因的良好載體！（6）mega質(zhì)粒（megaplasmid）

即巨大質(zhì)粒，其相對分子量比一般質(zhì)粒大幾十倍至幾百倍，存在于Rhizobium（根瘤菌屬）中，其上有一系列與共生固氮相關(guān)的基因。（7）降解質(zhì)粒

這類質(zhì)粒是由降解一系列復(fù)雜有機(jī)物的酶編碼，所以在污水處理、環(huán)境保護(hù)等方面發(fā)揮作用。只在假單胞菌屬