手足口病的病原學(xué)及實(shí)驗(yàn)室檢測

手足口病的病原學(xué)及實(shí)驗(yàn)室檢測第1頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六手足口病的病原引起手足口病的病毒屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，包括：*柯薩奇病毒A組（CoxasckievirusA,CVA）的2、4、5、7、9、10、16型等*B組（CoxasckievirusB,CVB)的1、2、3、4、5型等；*腸道病毒71型（HumanEnterovirus71,EV71）；*埃可病毒（Echovirus,ECHO）等。其中以EV71及CVA16型較為常見。腸道病毒適合在濕、熱的環(huán)境下生存與傳播，75%酒精和5%來蘇不能將其滅活，對乙醚、去氯膽酸鹽等不敏感；對紫外線和干燥敏感，各種氧化劑(高錳酸鉀、漂白粉等)、甲醛、碘酒以及56℃30分鐘可以滅活病毒。病毒在4℃可存活1年，-20℃可長期保存，在外環(huán)境中可長期存活。第2頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六人腸道病毒感染的一般致病機(jī)制進(jìn)入途徑口腔/呼吸道咽喉及下腸胃道傳播扁桃體、深層淋巴結(jié)、腸道淋巴結(jié)微病毒血癥先天性感染神經(jīng)系統(tǒng)心臟肝臟、胰臟、腎上腺呼吸系統(tǒng)皮膚及黏膜病毒血癥神經(jīng)系統(tǒng)抗體產(chǎn)生、病毒血癥消失，病毒感染癥狀改善飛沫、接觸、飲食肌肉第3頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六流行病學(xué)傳染源患者和隱性感染者。發(fā)病前數(shù)天，感染者咽部與糞便就可檢出病毒，通常以發(fā)病后一周內(nèi)傳染性最強(qiáng)。傳播途徑：可經(jīng)胃腸道（糞-口途徑）傳播，也可經(jīng)呼吸道（飛沫、咳嗽、打噴嚏等）傳播，亦可因接觸患者口鼻分泌物、皮膚或粘膜皰疹液及被污染的手及物品等造成傳播流行：以5歲及以下兒童為主，尤以3歲及以下兒童發(fā)病率最高。一般5-7月為發(fā)病高峰第4頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)室診斷——臨床診斷病例符合下列條件之一者，即可診斷為實(shí)驗(yàn)室確診病例

自咽拭子或咽喉洗液、糞便或肛拭子、腦脊液、皰疹液、血清以及腦、肺、脾、淋巴結(jié)等組織標(biāo)本中分離到人腸道病毒（指包括CVA16和EV71等有明確證據(jù)表明可以導(dǎo)致手足口病的人腸道病毒）。自咽拭子或咽喉洗液、糞便或肛拭子等標(biāo)本中檢測到CVA16或EV71特異性核酸，或從腦脊液、皰疹液、血清以及腦、肺、脾、淋巴結(jié)等組織標(biāo)本等標(biāo)本中檢測到人腸道病毒（指包括CVA16和EV71等有明確證據(jù)表明可以導(dǎo)致手足口病的人腸道病毒）的特異性核酸。第5頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)室診斷血清標(biāo)本人腸道病毒型特異性中和抗體滴度≥1∶256，或急性期與恢復(fù)期血清腸道病毒特異性中和抗體有4倍或4倍以上的升高第6頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六病原學(xué)監(jiān)測要求各省區(qū)市衛(wèi)生行政部門要組織醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)開展病原學(xué)監(jiān)測，了解病原動(dòng)態(tài)分布變化。所有重癥和死亡病例均需采樣。此外，以縣（區(qū)）為單位，每月最少需采集5例首次就診的普通病例標(biāo)本；當(dāng)月縣（區(qū)）病例總數(shù)少于5例時(shí)，全部采樣。以?。▍^(qū)、市）為單位,在手足口病流行年份中每年至少采集20對EV71和10對CVA16感染的手足口病患兒的雙份血清,以闡明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗體的動(dòng)態(tài)變化，評價(jià)血清學(xué)抗體試劑盒的敏感性和特異性。以?。▍^(qū)、市）為單位，每月至少從手足口病病例中分離10株毒株并做血清型別鑒定，鑒定完成后并將毒株及鑒定結(jié)果于5個(gè)工作日內(nèi)報(bào)送至中國疾病預(yù)防控制中心。具備測序條件的省份，可開展VP1基因序列測定和分析，進(jìn)行基因定型，序列測定完成后將序列結(jié)果于5個(gè)工作日內(nèi)報(bào)送至中國疾病預(yù)防控制中心；不具備測序條件者，將毒株送至中國疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行序列測定，中國疾病預(yù)防控制中心要于28個(gè)工作日內(nèi)反饋基因定型結(jié)果。第7頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六31個(gè)省級實(shí)驗(yàn)室1國家實(shí)驗(yàn)室331個(gè)地級實(shí)驗(yàn)室

腸道病毒分離物基因分型,血清流行病學(xué)檢測,診斷方法建立質(zhì)量控制對省級實(shí)驗(yàn)室提供技術(shù)支持腸道病毒分離和鑒定

(PCR,ICA,PCR-RFLP,realtimePCR）對地級實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制對地級實(shí)驗(yàn)室提供技術(shù)支持RT-PCR,RealtimePCR

采集標(biāo)本

中國腸道病毒三級實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)第8頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六標(biāo)本采集和檢測（1）所有重癥和死亡病例均要采集標(biāo)本，可以采集咽拭子、糞便或肛拭子、皰疹液、腦脊液、血清等，死亡病例還可采集腦、肺、腸淋巴結(jié)等組織標(biāo)本。聚集性病例至少要采集2例病例標(biāo)本開展病原學(xué)檢測。（2）醫(yī)療機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)樣本采集，疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)應(yīng)指導(dǎo)醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行相關(guān)生物學(xué)標(biāo)本的采集。（3）疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)根據(jù)本地的技術(shù)能力，對采集的標(biāo)本開展核酸檢測、病毒分離；不具備技術(shù)條件時(shí)，及時(shí)送上級機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測。第9頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六標(biāo)本的選擇糞便標(biāo)本、肛拭子（3日內(nèi),5-8g）咽拭子標(biāo)本(3日內(nèi),維持液)血清標(biāo)本（發(fā)病0-3天，14-30天）皰疹液（多個(gè)皰疹作為一個(gè)標(biāo)本）腦脊液標(biāo)本(出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3天內(nèi)）第10頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六

采集標(biāo)本的種類、保存和運(yùn)輸（一）糞便標(biāo)本。采集病人發(fā)病3日內(nèi)的糞便標(biāo)本，用于病原檢測。糞便標(biāo)本采集量5-8g/份，采集后立即放入無菌采便管內(nèi)，外表貼上帶有唯一識別號碼的標(biāo)簽，4℃暫存12小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，-20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標(biāo)本存于-70℃冰箱。第11頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六

采集標(biāo)本的種類、保存和運(yùn)輸（二）咽拭子標(biāo)本。采集病人發(fā)病3日內(nèi)的咽拭子標(biāo)本，用于病原檢測。用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應(yīng)避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有3-5ml保存液（含5%牛血清維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的15ml外螺旋蓋采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥，外表貼上帶有唯一識別號碼的標(biāo)簽。4℃暫存并在12小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，-20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標(biāo)本存于-70℃冰箱。第12頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六

采集標(biāo)本的種類、保存和運(yùn)輸（三）血清標(biāo)本。各?。▍^(qū)、市）在手足口病流行年份中均應(yīng)采集EV71和CVA16感染的手足口病患兒的雙份血清。采集急性期（發(fā)病0-7d）和恢復(fù)期（發(fā)病14-30d）雙份配對血清用于闡明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗體的動(dòng)態(tài)變化，評價(jià)血清學(xué)抗體試劑盒的敏感性和特異性。靜脈采集3-5ml全血，置于真空無菌采血管中，自凝后，分離血清，將血清移到2ml外螺旋的血清保存管中，外表貼上帶有唯一識別號碼的標(biāo)簽。將血清置于-20℃以下冰箱中冷凍保存。第13頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六（四）皰疹液在手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷中，從皰疹液中分離到病毒即可確診該病毒為病因，可同時(shí)采集多個(gè)皰疹作為一份標(biāo)本。先用75%的酒精對皰疹周圍的皮膚進(jìn)行消毒，然后用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內(nèi)裝有3-5ml保存液（含5%牛血清維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標(biāo)簽。所采集標(biāo)本4℃暫存立即（12h內(nèi)）送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標(biāo)本存于－70℃冰箱。第14頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六（五）肛拭子標(biāo)本采集病人發(fā)病3日內(nèi)的肛拭子標(biāo)本，用于病原檢測。用專用采樣棉簽，從患兒肛門輕輕插入，適度用力弧型左右擦拭數(shù)下，拔出后,迅速將棉簽放入裝有3－5ml保存液（含5%牛血清細(xì)胞維持液）的15ml外螺旋的采樣管中，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標(biāo)簽。在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋，并密封，以防干燥。第15頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六（六）尸檢標(biāo)本采集腦、肺和腸淋巴結(jié)等重要組織標(biāo)本，每一采集部位分別使用單獨(dú)的消毒器械。每種組織應(yīng)多部位取材，每部位應(yīng)取2-3份約5-10g的組織，淋巴結(jié)2個(gè)，分別置于15ml-50ml無菌的有外螺旋蓋的凍存管中，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標(biāo)簽。第16頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六（七）腦脊液標(biāo)本。出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的病例，可采集腦脊液標(biāo)本，進(jìn)行病毒分離或核酸檢測。采集時(shí)間為出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3天內(nèi)，采集量為1.0-2.0ml。采集后立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中，4℃暫存立即(12h內(nèi))送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標(biāo)本存于－70℃冰箱。但EV71感染神經(jīng)系統(tǒng)時(shí)，很難在腦脊液中檢測到EV71病原。第17頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六標(biāo)本運(yùn)輸和貯存注意事項(xiàng)

臨床標(biāo)本在運(yùn)輸和貯存過程中要避免反復(fù)凍融。標(biāo)本采集后要全程冷藏或冷凍保存和運(yùn)輸，12小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。依照《人間傳染的病原微生物名錄》，腸道病毒或潛在含有腸道病毒的標(biāo)本按B類包裝，置于冷藏保存盒內(nèi)運(yùn)輸，盡量縮短運(yùn)輸時(shí)間。可采用陸路或航空等多種運(yùn)輸方式，但在運(yùn)輸過程中應(yīng)采取保護(hù)措施，避免強(qiáng)烈震動(dòng)、重力擠壓等現(xiàn)象。在送到省、地、市級CDC實(shí)驗(yàn)室時(shí)，包裝盒內(nèi)應(yīng)帶冰且包裝完整。在上送標(biāo)本的同時(shí)，需附帶相關(guān)的《手足口病病例臨床標(biāo)本采樣登記表》。第18頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)室檢測病毒分離測定人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）Real-timeRT-PCR（rRT-PCR）第19頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六病毒分離病毒分離細(xì)胞系：

RD細(xì)胞，來源于人橫紋肌肉瘤細(xì)胞。

HEp-2細(xì)胞，來源于人喉癌上皮細(xì)糞便標(biāo)本和肛拭子的處理：按“手足口病標(biāo)本采集及檢測技術(shù)方案”皰疹液標(biāo)本通常直接用于RNA提取或病毒分離。腦脊液標(biāo)本通常直接用于病毒分離咽拭子標(biāo)本的處理：按“手足口病標(biāo)本采集及檢測技術(shù)方案”第20頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六咽拭子處理（病毒分離用）咽拭子要在標(biāo)本運(yùn)輸（保存）液中充分?jǐn)噭?dòng)（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細(xì)胞等，用于病毒分離時(shí)，需要凍融一次（防止多次凍融），使細(xì)胞破裂，釋放病毒顆粒。然后在4℃條件下，10000rpm離心20min，用上清接種到細(xì)胞上或直接提取RNA。如果發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌污染，須用濾器過濾除菌。第21頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六病毒分離結(jié)果解釋RD細(xì)胞支持HFMD的主要病原體——CVA16和EV71等多種腸道病毒的復(fù)制，CVA16和EV71均能在RD細(xì)胞培養(yǎng)中引起特殊的腸道病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、分散、胞漿內(nèi)顆粒增加，最后細(xì)胞自管壁脫落。但相同滴度的CVA16和EV71在RD細(xì)胞中生長的速度不同，EV71的生長速度要快于CVA16，表現(xiàn)為EV71感染RD細(xì)胞后出現(xiàn)CPE的時(shí)間比CVA16早，EV71接種細(xì)胞后出現(xiàn)CPE很快，但CVA16一般要經(jīng)過2次以上傳代才出現(xiàn)明顯的CPE。若在使用RD細(xì)胞分離的同時(shí)再增加HEp-2細(xì)胞，可提高腸道病毒的分離率（分離出其他可能致HFMD的病原體，如一些柯薩奇B組病毒）。但CVA16和EV71在HEp-2細(xì)胞中均不繁殖。第22頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六測定人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度比較患者急性期血清與恢復(fù)期血清中和抗體滴度，可作為腸道病毒感染的血清學(xué)診斷方法，最常用的是中和實(shí)驗(yàn)通常用急性期血清與恢復(fù)期血清滴度進(jìn)行比較，抗體滴度4倍或4倍以上增高證明病毒感染。腸道病毒隱性感染也很常見，所以在評估檢測結(jié)果時(shí)就要小心一些第23頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六中和試驗(yàn)結(jié)果判定如果恢復(fù)期血清較急性期血清EV71或CVA16中和抗體滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上增高即可確診；如果恢復(fù)期血清較急性期血清其它腸道病毒中和抗體滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上增高可證實(shí)該腸道病毒感染，是否為病因需要其它相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)；如果單份血清中和抗體滴度大于1:256也有診斷意義，血清中和抗體滴度為1:128判定為可疑陽性。第24頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）的標(biāo)本處理糞便標(biāo)本：采用氯仿進(jìn)行處理后提取核酸。肛拭子/咽拭子標(biāo)本：咽拭子要在標(biāo)本保存液中充分?jǐn)噭?dòng)，然后在4℃條件下，10000rpm離心20min。皰疹液和腦脊液：直接用于RNA提取第25頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果解釋表待檢標(biāo)本RT-PCR結(jié)果 鑒定結(jié)果 HEV(-),EV71(-),CVA16(-) 非腸道病毒（NEV） HEV(+),EV71(-),CVA16(-) 非EV71、CVA16的其它腸道病毒 HEV(+),EV71(+),CVA16(-) EV71 HEV(+),EV71(-),CVA16(+)CVA16第26頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六RT-PCR注意事項(xiàng)按下列好的實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程操作，可以減少交叉污染的發(fā)生

PCR之前的準(zhǔn)備工作和之后的處理分別在不同的房間內(nèi)操作；

PCR之前的準(zhǔn)備工作和之后的處理分別使用兩套移液器以及其他設(shè)備；將試劑分裝保存，盡量減少重復(fù)使用的頻率；準(zhǔn)備和分裝試劑應(yīng)該在無PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行；準(zhǔn)備寡聚核苷酸引物應(yīng)該在無PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的環(huán)境中進(jìn)行；只使用能阻止氣溶膠產(chǎn)生的吸尖；戴手套（無滑石粉），并經(jīng)常更換；第27頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六RT-PCR注意事項(xiàng)打開各種管子要小心，避免氣溶膠的產(chǎn)生。減少每次處理樣品的數(shù)量；將除了核酸之外的其他試劑先加到反應(yīng)管中，最后再加入核酸；加入一個(gè)核酸后要蓋上蓋子，然后再加入其它核酸；使用陽性對照；選取一個(gè)穩(wěn)定的每次都能擴(kuò)增出結(jié)果的樣品作陽性對照；使用一個(gè)已知性質(zhì)的樣品作陰性對照；每次實(shí)驗(yàn)都要用試劑混合物作為空白對照。它包含除了標(biāo)本RNA以外的PCR反應(yīng)所需的所有其它成分。第28頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六Real-timeRT-PCR（rRT-PCR）與普通PCR模式相比,實(shí)時(shí)熒光PCR具備幾個(gè)方面的優(yōu)勢:封閉反應(yīng)，污染機(jī)會(huì)少。無需PCR后處理（雜交，電泳，拍照）。操作簡單，高度自動(dòng)化。特異性強(qiáng)，靈敏度高。用途廣泛，既能定量又能定性。采用對數(shù)期分析，摒棄終點(diǎn)數(shù)據(jù)，定量準(zhǔn)確。儀器在線式實(shí)時(shí)檢測，結(jié)果直觀，避免人為判斷?？蓪?shí)現(xiàn)一管雙檢或多檢。操作安全，縮短時(shí)間，提高效率。熒光定量PCR是通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時(shí)檢測從而實(shí)現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。第29頁，共33頁，2023年，2月20日，星期六rRT-PCR注意事項(xiàng)模板量可根據(jù)樣本情況自行決定（臨床標(biāo)本通常使用5ul模板量），不夠部分以水補(bǔ)足。如選用另外