CRISPRCas精細(xì)原理基因敲除點(diǎn)突變基因插入演示文稿

CRISPRCas精細(xì)原理基因敲除點(diǎn)突變基因插入演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有14頁\編輯于星期日CRISPR-Cas系統(tǒng)簡介CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用技術(shù)CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用前景contents現(xiàn)在是2頁\一共有14頁\編輯于星期日1.CRISPR-Cas系統(tǒng)簡介1.1CRISPR-Cas系統(tǒng)的研究歷史1987年，日本課題組在K12大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列，隨后發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中，2002年，正式將其命名為成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列2005年發(fā)現(xiàn)CRISPR的間隔序列(spacer)與宿主菌的染色體外的遺傳物質(zhì)高度同源，推測(cè)細(xì)菌可能通過CRISPR系統(tǒng)可能以類似于真核生物的RNAi方式抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵。2007年，Barrangou等首次發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可能利用CRSPR系統(tǒng)抵抗噬菌體入侵；2008年，Marraffini等發(fā)現(xiàn)細(xì)菌CRISPR系統(tǒng)能阻止外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，首次利用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CRISPR系統(tǒng)的功能2013年初，MIT的研究組首次利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)人293T細(xì)胞EMX1

和PVALB基因以及小鼠Nero2A細(xì)胞Th基因?qū)崿F(xiàn)了定點(diǎn)突變。同年Mali利用CRISPR/Cas9在人293T細(xì)胞和K652細(xì)胞基因的靶位點(diǎn)形成雙鏈或單鏈的切口，從而激活細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制高效介導(dǎo)外源基因定點(diǎn)插入?，F(xiàn)在是3頁\一共有14頁\編輯于星期日

1.2CRISPR-Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)CRISPR-CAS系統(tǒng)的組成主要包括:由不連續(xù)的重復(fù)序列R(repeat)與長度相似的間區(qū)序列S(spacers)間隔排列而成的CRISPR簇，前導(dǎo)序列L(leader)以及一系列CRISPR相關(guān)蛋白基因cas。

Cas蛋白是一種雙鏈DNA核酸酶，能在guideRNA引導(dǎo)下對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。它與folk酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用?，F(xiàn)在是4頁\一共有14頁\編輯于星期日1.3CRISPR-CAS系統(tǒng)的作用機(jī)理

CRISPR的高度可變的間隔區(qū)的獲得

首先識(shí)別入侵的核酸和掃描外源DNA潛在的PAM（NGG序列），將臨近PAM的序列作為候選protospacer；然后在CRISPR基因座的5'端合成重復(fù)序列；最后新的間隔序列整合到兩個(gè)重復(fù)序列之間現(xiàn)在是5頁\一共有14頁\編輯于星期日1.3CRISPR-CAS系統(tǒng)的作用機(jī)理CRIPSR基因座的表達(dá)(包括轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的成熟加工)當(dāng)該噬菌體再次入侵細(xì)菌時(shí)，CRISPR簇首先轉(zhuǎn)錄為長的crRNA前體，然后逐步被加工成小的成熟的crRNA。CRISPR/Cas系統(tǒng)活性的發(fā)揮或者是對(duì)外源遺傳物質(zhì)的干擾crRNA結(jié)合相關(guān)的Cas蛋白后，形成crRNA-Cas蛋白復(fù)合體，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)精確地與目標(biāo)DNA相結(jié)合，隨后Cas蛋白對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行斷裂和降解?，F(xiàn)在是6頁\一共有14頁\編輯于星期日1.3CRISPR-CAS系統(tǒng)的作用機(jī)理現(xiàn)在是7頁\一共有14頁\編輯于星期日2、CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用2.1CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組精確編輯技術(shù)基因組編輯技術(shù)是一種可以在基因組水平上對(duì)DNA序列進(jìn)行改造的遺傳操作技術(shù)。這種技術(shù)的原理是構(gòu)建一個(gè)人工內(nèi)切酶，在預(yù)定的基因組位置切斷DNA，切斷的DNA在被細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)過程中會(huì)產(chǎn)生突變，從而達(dá)到定點(diǎn)改造基因組的目的。通過修復(fù)途徑，基因組編輯技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)三種基因組改造，即基因敲除，特異突變的引入和定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因基因組編輯是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人類遺傳性疾病的治療，因此這類技術(shù)成為現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)現(xiàn)在是8頁\一共有14頁\編輯于星期日2.1CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組精確編輯技術(shù)

CRISPRs技術(shù)是一種由RNA指導(dǎo)Cas蛋白對(duì)靶向基因進(jìn)行修飾的技術(shù)。Mali等人利用來自釀膿鏈球菌和嗜熱鏈球菌中的CRISPR相關(guān)蛋白Cas9，在一段人為重組的sgRNA(small-guideRNA)的引導(dǎo)下，針對(duì)小鼠和人類基因組的特定基因片段實(shí)現(xiàn)了精確的剪切。這種通過可編程RNA進(jìn)行DNA改造的技術(shù)為基因組編輯開創(chuàng)了一條新的途徑?，F(xiàn)在是9頁\一共有14頁\編輯于星期日例子：基因敲除的實(shí)驗(yàn)過程1、在把基因序列中尋找NGG序列獲得其附近20多個(gè)堿基的序列，與tracrRNA序列融合，設(shè)計(jì)出sgRNA并合成該序列。2、將該序列以及cas9基因連入如圖所示載體。3、轉(zhuǎn)化感受態(tài)，質(zhì)粒小提，測(cè)序驗(yàn)證。4、細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞轉(zhuǎn)染5、敲除效果檢測(cè)。6、建立穩(wěn)定敲除的細(xì)胞株現(xiàn)在是10頁\一共有14頁\編輯于星期日2.2CRISPR/Cas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制與轉(zhuǎn)錄激活

在CRISPR/Cas9的Ⅱ型系統(tǒng)中將Cas9中的切割域突變，會(huì)使Cas9蛋白失去對(duì)ＤＮＡ的切割活性，但不影響其與ＤＮＡ結(jié)合的能力。這種失去ＤＮＡ切割活性的Cas9蛋白被命名為DeadＣas9。將ｄCas9與gRNA在細(xì)胞中共表達(dá)，則gRNA可以介導(dǎo)ｄCas9蛋白與ＤＮＡ結(jié)合。如果ｄCas9結(jié)合到靶基因的閱讀框內(nèi)，可阻斷RNA聚合酶的延伸作用；如果ｄCas9結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域則可阻止基因轉(zhuǎn)錄的起始現(xiàn)在是11頁\一共有14頁\編輯于星期日2.2CRISPR/Cas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制與轉(zhuǎn)錄激活CRISPR／Cas9系統(tǒng)用于轉(zhuǎn)錄抑制需要PAM（３bp）和至少12bp的gRNA－ＤＮＡ配對(duì)利用crＲＮＡ介導(dǎo)dCas9能夠精確識(shí)別靶基因的特點(diǎn)，將ｄCas蛋白與具有轉(zhuǎn)錄激活的蛋白質(zhì)功能域融合則可構(gòu)建具有轉(zhuǎn)錄激活活性的CRISPR－on系統(tǒng)。真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄激活因子可通過將ｄCas9與單純皰疹病毒轉(zhuǎn)錄激活子ＶＰ16結(jié)合獲得。現(xiàn)在是12頁\一共有14頁\編輯于星期日3、CRISPR-Cas9技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與前景3.1CRISPR-Cas9技術(shù)的優(yōu)勢(shì)而且從實(shí)際應(yīng)用的角度來說，CRISPRs比TALENs更容易操作，因?yàn)槊恳粚?duì)TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替換20個(gè)核苷酸就行。只需合成一個(gè)sgRNA就能實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的特異性修飾，Cas蛋白不具特異性。編碼sgRNA的序列不超過100bp，因此比構(gòu)TALENs和ZFNs更簡單方便。較短的sgRNA序列也避免了超長、高度重復(fù)TALENs編碼載體帶來的并發(fā)癥?，F(xiàn)在是13頁\一共有14頁\編輯于星期日3.2CRISPR-Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用前景目前應(yīng)用CRISPR-Cas9系統(tǒng)的研究主要集中在基因編輯方面。而Cas9真正的優(yōu)勢(shì)主要在于它具有能夠?qū)ⅲ撤N主要生物聚合物（ＤＮＡ、ＲＮＡ和蛋白質(zhì)）結(jié)合在一起的特殊能力。各種功能性蛋白都可以通過與Cas9蛋白融合，然后利用gRNA的靶向作用結(jié)合到dsＤＮＡ的任意位點(diǎn)，發(fā)揮人們預(yù)期的功