抗體工程藥物專家講座

第一講

抗體工程藥品1抗體工程藥物第1頁抗體工程藥品概念又稱抗體藥品、單克隆抗體治療劑、抗體治療劑。

經(jīng)過細(xì)胞工程或基因工程方法制備，用于治療單克隆抗體、抗體片段、基因工程改造抗體，以及抗體免疫偶聯(lián)物或抗體融合蛋白,稱為抗體工程藥品。2抗體工程藥物第2頁抗體藥品主要地位。惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人們生命健康，是造成人類死亡主要原因。全球每年有700萬人死于腫瘤，且逐年增加。傳統(tǒng)腫瘤臨床治療有三種：手術(shù)、放療和化療。近幾年里，以單克隆抗體為基礎(chǔ)抗腫瘤導(dǎo)向治療藥品開發(fā)領(lǐng)域發(fā)生了突飛猛進(jìn)進(jìn)展。單克隆抗體藥品能特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞，能有效提升藥品殺傷力、降低毒副作用。1997年以來，F(xiàn)DA已經(jīng)同意10種單克隆抗體藥品，占有市場(chǎng)全部生物技術(shù)藥品四分之一。一年綜合銷售超出10億美金。

3抗體工程藥物第3頁伴隨生物技術(shù)發(fā)展，單克隆抗體在疾病治療方面作用越來越受到人們重視。在同種異體免疫排斥、本身免疫反應(yīng)抑制、抗血小板治療、癌癥治療、感染性疾病治療等方面應(yīng)用最為廣泛。當(dāng)前全球從事人源化單克隆抗體開發(fā)企業(yè)260家左右，研究中產(chǎn)品達(dá)700多個(gè)，其中進(jìn)入臨床階段約100個(gè)，預(yù)計(jì)占研制中生物技術(shù)藥品25%。據(jù)美國(guó)制藥工業(yè)協(xié)會(huì)調(diào)查匯報(bào)顯示，單克隆抗體藥品居全部醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品之首。4抗體工程藥物第4頁年底，在美國(guó)藥品市場(chǎng)上生物技術(shù)藥品有76種，其中抗體藥品有15種；正處于臨床研究階段369種生物技術(shù)藥品中，抗體藥品有70種。

中國(guó)已經(jīng)有2個(gè)治療性單抗產(chǎn)品獲準(zhǔn)生產(chǎn)，3個(gè)治療性產(chǎn)品處于臨床試驗(yàn)階段，多個(gè)抗體藥品處于臨床前研究階段，已同意診療性單抗有31個(gè)。5抗體工程藥物第5頁6抗體工程藥物第6頁國(guó)內(nèi)抗體藥品總體情況4個(gè)主要重組抗體類產(chǎn)品（益賽普、利卡汀、泰欣生、健尼哌）年本土企業(yè)銷售額10億元，同比增加80%年僅占國(guó)內(nèi)藥品市場(chǎng)0.7%7抗體工程藥物第7頁共性關(guān)鍵技術(shù)問題中國(guó)國(guó)際原創(chuàng)性稀缺

（人源化少）普遍（人源化）上市抗體藥品9個(gè)41個(gè)產(chǎn)業(yè)規(guī)模2-3億美元（國(guó)產(chǎn)）>600億美元抗體表示量1g／L～4g／L細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)500－3000L10000L－25000L大分子制劑技術(shù)凍干粉和水針高濃度制劑、靶向制劑等培養(yǎng)基和純化介質(zhì)自主產(chǎn)品少占?jí)艛嗟匚?抗體工程藥物第8頁山東是醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)大省，規(guī)模以上醫(yī)藥企業(yè)到達(dá)646家9抗體工程藥物第9頁海南黑龍江吉林遼寧河北山東福建江西安徽湖北湖南廣東廣西上海河南山西內(nèi)蒙古陜西寧夏甘肅青海四川貴州云南西藏新疆江蘇浙江北京臺(tái)灣國(guó)產(chǎn)：9個(gè)上海4北京1廣東1湖北1四川1遼寧1進(jìn)口：11個(gè)上市抗體藥品分布圖10抗體工程藥物第10頁阿司匹林

（180Da）

胰島素

（～5.8kDa）IgG單克隆抗體

（～150kDa）11抗體工程藥物第11頁抗體制藥抗體藥品中試及產(chǎn)業(yè)化大分子制劑抗體藥品評(píng)價(jià)與表征分析細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)關(guān)鍵原材料12抗體工程藥物第12頁抗體分子應(yīng)用抗體分子是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域用途最為廣泛蛋白分子。以腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)性抗原、抗體獨(dú)特型決定簇、細(xì)胞因子及其受體、激素及一些癌基因產(chǎn)物等均作為靶分子，利用傳統(tǒng)免疫方法或經(jīng)過細(xì)胞工程、基因工程等技術(shù)制備多克隆抗體、單克隆抗體、基因工程抗體廣泛應(yīng)用在疾病診療、治療及科學(xué)研究等領(lǐng)域。完整鼠源抗體輕易引發(fā)機(jī)體排異反應(yīng)，而基因工程抗體因?yàn)榉肿恿啃?，?jīng)過改造能夠降低鼠源性，所以是生物技術(shù)制藥領(lǐng)域研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。13抗體工程藥物第13頁當(dāng)前正在進(jìn)行開發(fā)和已經(jīng)投入市場(chǎng)抗體性藥品主要有以下幾個(gè)用途：

1．器官移植排斥反應(yīng)逆轉(zhuǎn)；

2．腫瘤免疫診療；

3．腫瘤免疫顯像；

4．腫瘤導(dǎo)向治療；

5．哮喘、牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、急性心梗、膿毒癥、多發(fā)性硬化癥及其它本身免疫性疾??；

6．抗獨(dú)特型抗體作為分子瘤苗治療腫瘤；

7．多功效抗體（雙特異抗體、三特異抗體、抗體細(xì)胞因子融合蛋白、抗體酶等）特殊用途。

14抗體工程藥物第14頁依據(jù)美國(guó)藥品研究和生產(chǎn)者協(xié)會(huì)（PhRMA）調(diào)查匯報(bào)，癌癥是威脅人類健康主要疾病之一，預(yù)防和治療癌癥是研究和開發(fā)抗體藥品主要目標(biāo)之一。最初抗體主要被用于腫瘤體外免疫診療和體內(nèi)免疫顯像，伴隨抗體工程技術(shù)不停進(jìn)步，近年來人們將更多目光集中在治療腫瘤抗體藥品開發(fā)上。第一個(gè)被美國(guó)同意用于人腫瘤治療基因工程抗體－Rituxan（r）最初被用于非何杰金氏淋巴瘤，總有效率達(dá)60％，現(xiàn)在正在探索用于治療艾滋病相關(guān)淋巴瘤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤。

15抗體工程藥物第15頁當(dāng)前在臨床中使用腫瘤治療藥品多數(shù)存在“敵我不分”問題，即在殺死腫瘤細(xì)胞同時(shí)，也破壞了人體正常細(xì)胞。“生物導(dǎo)彈”為處理這個(gè)難題提供了一個(gè)理想思緒?！吧飳?dǎo)彈”，即將各種毒素、放射性同位素、化療藥品與識(shí)別腫瘤特異抗原或偶聯(lián)腫瘤相關(guān)抗原后，能夠特異殺傷腫瘤細(xì)胞一類藥品。這種藥品經(jīng)由靜脈注入人體內(nèi)，藥效分子集中作用于腫瘤細(xì)胞，既增強(qiáng)療效又降低對(duì)機(jī)體毒副作用。放射性同位素與抗體偶聯(lián)物在體內(nèi)能將前者運(yùn)至藥靶部位，并經(jīng)過其放射性活性殺傷靶細(xì)胞，還可經(jīng)過X射線攝影機(jī)拍攝核素放射線圖像，用于體內(nèi)治療和定位診療。16抗體工程藥物第16頁抗體與化療藥品分子偶聯(lián)方法普通采取化學(xué)法。這些偶聯(lián)物對(duì)結(jié)腸癌、肝癌、胃癌、黑色素瘤、腎癌、卵巢癌、宮頸癌、乳癌、肺癌、骨肉瘤等有一定抗癌效應(yīng)。抗體與生物毒素交聯(lián)制備偶聯(lián)物稱為免疫毒素。免疫毒素抗體部分對(duì)對(duì)應(yīng)抗原有特異識(shí)別作用，及免疫毒素部分含有對(duì)細(xì)胞毒作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞含有殺傷效應(yīng)，是很有潛力免疫治療方法。17抗體工程藥物第17頁抗腫瘤血管生成抗體治療腫瘤研究最近也取得了很大進(jìn)展。在動(dòng)物模型中用抗血管生成因子、抗體封閉血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子取得了抑制腫瘤生長(zhǎng)作用；抗癌基因產(chǎn)物抗體Herceptin（r）作為生物技術(shù)藥品已經(jīng)在美國(guó)上市，配合化療用于乳腺癌和卵巢癌治療，并取得很好療效。18抗體工程藥物第18頁1．單克隆抗體（McAb）抗體作為免疫治療生物制劑，在臨床應(yīng)用已經(jīng)有一個(gè)世紀(jì)。以前抗體主要來自于經(jīng)抗原免疫異種動(dòng)物（如馬）血清。淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，能夠大量制備針對(duì)任何抗原決定基單克隆抗體。19抗體工程藥物第19頁抗T細(xì)胞及其亞類抗CD3、抗CD4、抗CD8單克隆抗體，它們?cè)谝浦才懦饧耙恍┍旧砻庖卟?yīng)用中，已取得了顯著療效?？垢鞣N細(xì)胞表面分子單克隆抗體，如抗IL-2受體單克隆抗體，抗粘附分子單克隆抗體都有顯著免疫調(diào)整作用，在本身免疫病治療，預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移等方面都有主要使用潛力。20抗體工程藥物第20頁單克隆抗體另一主要應(yīng)用是腫瘤診療及分型。在過去10多年來，抗各種人腫瘤相關(guān)抗原單克隆抗體得到了廣泛研究。針對(duì)各種人腫瘤細(xì)胞單克隆抗體都能較特異地識(shí)別腫瘤細(xì)胞，而基本上不與正常組織起反應(yīng)?？鼓[瘤單克隆抗體在腫瘤診療及分型方面是一個(gè)有用工具；但在腫瘤治療上，因?yàn)榇蠖嗫鼓[瘤單克隆抗體不能直接殺傷腫瘤細(xì)胞，所以單獨(dú)應(yīng)用腫瘤沒有顯著效果。21抗體工程藥物第21頁2．導(dǎo)向藥品（targeteddrug）利用抗腫瘤單克隆抗體特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞特點(diǎn)，將它作為導(dǎo)向載體與各種殺傷分子，如毒素、抗癌藥品、放射性核素等，進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，能夠構(gòu)建成一個(gè)對(duì)腫瘤細(xì)胞含有高度特異強(qiáng)殺傷活性雜交分子，稱為導(dǎo)向藥品。22抗體工程藥物第22頁抗腫瘤單抗與毒素交聯(lián)物又稱免疫毒素(IT)。用于制備IT毒素主要有：①植物毒蛋白這類毒素主要有篦麻毒素（ricin）、相思子毒素（abrin）以及苦瓜毒素（mormordin）、商陸抗病毒蛋白（PAP）、天花粉蛋白等。它們都能夠經(jīng)過滅活核糖體，阻斷蛋白質(zhì)合成，殺傷靶細(xì)胞。。23抗體工程藥物第23頁②細(xì)胞毒素主要有白喉外毒素（DT），綠膿桿菌外毒素（PE）等。它們主要經(jīng)過抑制延長(zhǎng)因子-2阻斷蛋白質(zhì)合成，殺死靶細(xì)胞。上述這些毒素都含有極強(qiáng)毒性，1個(gè)分子篦麻毒素進(jìn)入細(xì)胞，就足以殺死該細(xì)胞24抗體工程藥物第24頁抗腫瘤單克隆抗體與抗癌藥品交聯(lián)物，又稱免疫交聯(lián)物(immunoconjugate)。用以制備這類導(dǎo)向藥品抗癌藥品主要有阿霉素（adriamycin）、氨甲蝶呤（MTX）等。它們主要經(jīng)過阻斷DNA合成來殺死靶細(xì)胞。抗癌藥品殺細(xì)胞作用比毒素低得多，增加抗體分子攜帶藥品分子數(shù)，能夠增強(qiáng)其殺傷活性，但常會(huì)造成抗體活性下降與喪失。這類導(dǎo)向藥品優(yōu)點(diǎn)是分子較小，同時(shí)如有非特異殺傷不會(huì)有嚴(yán)重后果。缺點(diǎn)：殺傷力不高，臨床應(yīng)用前景不被看好。25抗體工程藥物第25頁Ⅰ、放射性免疫交聯(lián)物可用于腫瘤診療。與腫瘤細(xì)胞結(jié)合放射性免疫交聯(lián)物放出γ射線，能夠用γ照像機(jī)攝像，取得清楚腫瘤顯像。此技術(shù)稱為放射免疫顯像。Ⅱ、放射性免疫交聯(lián)物也可用于腫瘤治療。標(biāo)識(shí)了大量高能核素抗腫瘤單克隆抗體與腫瘤細(xì)胞結(jié)合后，能夠經(jīng)過輻射損傷殺死靶細(xì)胞及其周圍腫瘤細(xì)胞。此技術(shù)又稱為放射免疫治療。用于與抗腫瘤單克隆抗體交聯(lián)放射性核素主要有125Ⅰ、131Ⅰ、111In等。26抗體工程藥物第26頁（四）腫瘤疫苗腫瘤疫苗與傳統(tǒng)疫苗在概念上不一樣，它主要不是用于腫瘤預(yù)防，而是經(jīng)過瘤苗接種來刺激機(jī)體對(duì)腫瘤免疫應(yīng)答來治療腫瘤。因?yàn)槿四[瘤相關(guān)抗原免疫原性很弱，不足以有效地刺激機(jī)體免疫應(yīng)答，所以單純用本身或同種腫瘤細(xì)胞作瘤苗治療腫瘤效果不好。用腫瘤細(xì)胞卡介苗等佐劑聯(lián)合應(yīng)用，能提升免疫應(yīng)答效果，在一些晚期腫瘤患者取得了一定治療效果。27抗體工程藥物第27頁腫瘤疫苗主要有二類：第一類對(duì)腫瘤抗原表位性質(zhì)研究，造成了腫瘤分子疫苗產(chǎn)生。含有腫瘤抗原決定基肽疫苗和多糖疫苗已在研制，有已在臨床試用。第二類，確定了抗腫瘤免疫應(yīng)答主要效應(yīng)細(xì)胞是TC細(xì)胞，造成了基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞疫苗出現(xiàn)。28抗體工程藥物第28頁TC細(xì)胞識(shí)別腫瘤表面肽抗原（peptide）與MHCⅠ類分子復(fù)合物，必需要有第二信號(hào)才能活化。這個(gè)第二信號(hào)能夠由TC細(xì)胞表面CD28分子與粘附分子B7結(jié)合來提供。（B7分子主要存在于活化B細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞表面。）在通常性況下，腫瘤細(xì)胞合成胞內(nèi)抗原經(jīng)胞內(nèi)降解、處理后，形成腫瘤肽抗原與MHCⅠ類分子結(jié)合復(fù)合物，共表示于瘤細(xì)胞表面。29抗體工程藥物第29頁大多數(shù)腫瘤細(xì)胞因?yàn)闆]有B7分子，所以腫瘤細(xì)胞雖含有肽抗原與MHCⅠ類分子復(fù)合物，但因?yàn)椴荒芴峁┑诙盘?hào)，所以不能活化TC細(xì)胞。IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ等基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞本身能夠分泌細(xì)胞因子，造成抗腫瘤免疫應(yīng)答產(chǎn)生。試驗(yàn)研究發(fā)覺，接種了工程化腫瘤細(xì)胞后，原先已生長(zhǎng)親本野生型腫瘤細(xì)胞開始消退；而且以后再接種野生型腫瘤細(xì)胞也不再生長(zhǎng)，這說明工程化腫瘤細(xì)胞含有經(jīng)典抗腫瘤疫苗效應(yīng)。有意義是，用放射線將這種工程瘤苗殺傷死后，依然能夠取得相同抗腫瘤效果。30抗體工程藥物第30頁免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說提出

這一學(xué)說是Jerne（1972）依據(jù)當(dāng)代免疫學(xué)反抗體分子獨(dú)特型認(rèn)識(shí)而提出。這一學(xué)說認(rèn)為在抗原刺激發(fā)生之前，機(jī)體處于一個(gè)相正確免疫穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)抗原進(jìn)入機(jī)體后打破了這種平衡，造成了特異抗體分子產(chǎn)生，當(dāng)?shù)竭_(dá)一定量時(shí)將引發(fā)抗Ig分子獨(dú)特型免疫應(yīng)答，即抗體產(chǎn)生。31抗體工程藥物第31頁抗體分子在識(shí)別抗原同時(shí)，也能被其它抗體分子所識(shí)別。在同一動(dòng)物體內(nèi)一組抗體分子上獨(dú)特型決定簇可被另一組抗獨(dú)特型抗體分子所識(shí)別。而一組淋巴細(xì)胞表面抗原受體分子亦可被另一組淋巴細(xì)胞表面抗獨(dú)特型抗體分子所識(shí)別。這么在體內(nèi)就形成了淋巴細(xì)胞與抗體分子所組成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。網(wǎng)絡(luò)學(xué)說認(rèn)為：這種抗體產(chǎn)生在免疫應(yīng)答調(diào)整中起著主要作用。使受抗原刺激增殖克隆受到抑制，而不至于無休止地進(jìn)行增殖，藉以維持免疫應(yīng)答穩(wěn)定平衡。

32抗體工程藥物第32頁抗體藥品特異性特異性與相關(guān)抗原特異性結(jié)合對(duì)腫瘤等靶細(xì)胞選擇性殺傷作用多樣性抗原多樣性抗體結(jié)構(gòu)多樣性抗體活性多樣性免疫偶聯(lián)物多樣性制備時(shí)定向性針對(duì)特定靶分子定向制備抗體藥品依據(jù)需要選擇抗體藥品“效應(yīng)分子”33抗體工程藥物第33頁單克隆抗體針對(duì)特定單一抗原表位，含有高度特異性，這是抗體藥品發(fā)揮治療作用主要基礎(chǔ)。單克隆抗體技術(shù)由英國(guó)劍橋科學(xué)家米爾斯坦（Milstein）和科勒（Kohler）于1975年首度研制。單抗作為治療劑研究經(jīng)歷了比較波折發(fā)展過程，上個(gè)世紀(jì)80年代迅猛發(fā)展；90年代早期又一度處于低谷；近年再度成為生物技術(shù)藥品領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。當(dāng)前，單抗藥品品種數(shù)量位居前列。34抗體工程藥物第34頁單抗藥品含有以下主要特點(diǎn)：其一，特異性。單抗針對(duì)特定單一抗原表位，含有高度特異性，這是單抗藥品發(fā)揮治療作用主要基礎(chǔ)。對(duì)于抗腫瘤抗體藥品研究表明，其特異性主要表現(xiàn)為特異性結(jié)合、選擇性殺傷、體內(nèi)靶向性分布以及含有更強(qiáng)療效。其二，多樣性。主要表現(xiàn)在抗原多樣性、抗體結(jié)構(gòu)多樣性，作用機(jī)理多樣性等方面。35抗體工程藥物第35頁其三，制備單抗藥品定向性。單抗藥品主要特點(diǎn)之一是能夠定向制造。即依據(jù)需要，能夠制備含有不一樣治療作用單抗藥品。能夠針對(duì)特定靶分子，定向制備對(duì)應(yīng)抗體；也能夠依據(jù)需要選擇對(duì)應(yīng)“效應(yīng)分子”，制備對(duì)應(yīng)免疫偶聯(lián)物或融合蛋白。36抗體工程藥物第36頁抗體工程發(fā)展簡(jiǎn)史多克隆抗體階段，早在1890年，培林(vonBehring)和北里(Kitasato)，就在試驗(yàn)室制造出抗白喉?xiàng)U菌外毒素血清用于治療白喉。1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出均一性單克隆抗體，叫細(xì)胞工程抗體。在80年代初，抗體基因結(jié)構(gòu)和功效研究結(jié)果與重組DNA技術(shù)相結(jié)合，產(chǎn)生了基因工程抗體技術(shù)，1984年第一個(gè)基因工程抗體人－鼠嵌合抗體誕生。1994年，Winter等人抗體庫技術(shù)：噬菌體抗體庫技術(shù)；核糖體展示抗體庫技術(shù)。37抗體工程藥物第37頁抗體工程發(fā)展歷程抗體作為疾病預(yù)防、診療和治療制劑已經(jīng)有上百年發(fā)展歷史。早期制備抗體方法是將某種天然抗原經(jīng)各種路徑免疫動(dòng)物，成熟B細(xì)胞克隆受到抗原刺激后，將抗體分泌到血清和體液中。實(shí)際上血清中抗體是各種單克隆抗體混合物，所以稱之為多克隆抗體。多克隆抗體是人類有目標(biāo)利用抗體第一步。多克隆抗體不均一性，限制了反抗體結(jié)構(gòu)和功效深入研究和應(yīng)用。38抗體工程藥物第38頁這種單克隆抗體多是由鼠B細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞分泌，含有鼠源性，進(jìn)入人體會(huì)引發(fā)機(jī)體排異反應(yīng)；完整抗體分子分子量較大，在體內(nèi)穿透血管能力較差；生產(chǎn)成本太高，不適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出均一性單克隆抗體。雜交瘤單克隆抗體又稱細(xì)胞工程抗體。雜交瘤技術(shù)誕生被認(rèn)為是抗體工程發(fā)展第一次質(zhì)飛躍，也是當(dāng)代生物技術(shù)發(fā)展一個(gè)里程碑。

39抗體工程藥物第39頁基因工程抗體優(yōu)點(diǎn)：1．經(jīng)過基因工程技術(shù)改造，能夠降低甚至消除人體反抗體排斥反應(yīng)；

2．基因工程抗體分子量較小，能夠部分降低抗體鼠源性，更有利于穿透血管壁，進(jìn)入病灶關(guān)鍵部位；

3．依據(jù)治療需要，制備新型抗體；

4．能夠采取原核細(xì)胞、真核細(xì)胞和植物等各種表示方式，大量表示抗體分子，大大降低生產(chǎn)成本。

40抗體工程藥物第40頁自從1984年第一個(gè)基因工程抗體人－鼠嵌合抗體誕生以來，新型基因工程抗體不停出現(xiàn)。如人源化抗體、單價(jià)小分子抗體（Fab、單鏈抗體、單域抗體、超變區(qū)多肽等）、多價(jià)小分子抗體（雙鏈抗體，三鏈抗體，微型抗體）、一些特殊類型抗體（雙特異抗體、抗原化抗體、細(xì)胞內(nèi)抗體、催化抗體、免疫脂質(zhì)體）及抗體融合蛋白（免疫毒素、免疫粘連素）等。用于構(gòu)建基因工程抗體抗體基因最初起源于雜交瘤細(xì)胞，所以一樣必須經(jīng)過動(dòng)物免疫，細(xì)胞融合及克隆篩選這么一個(gè)長(zhǎng)久、復(fù)雜工藝流程；依然不能制備針對(duì)稀有抗原抗體和人源性抗體，無法改進(jìn)抗體親和力。41抗體工程藥物第41頁這些缺點(diǎn)限制了基因工程抗體更為廣泛應(yīng)用。噬菌體抗體庫是應(yīng)用最為普遍抗體庫技術(shù)。采取噬菌體抗體庫技術(shù)篩選抗體無須進(jìn)行動(dòng)物免疫，易于制備稀有抗原抗體、篩選全人源性抗體和高親和力抗體。42抗體工程藥物第42頁噬菌體抗體庫技術(shù)是生命科學(xué)研究突破性進(jìn)展之一，同時(shí)也將抗體工程研究推想了一個(gè)新高潮。在噬菌體抗體庫基礎(chǔ)上，近幾年又發(fā)展了核糖體展示抗體庫技術(shù)。利用核糖體展示技術(shù)篩選抗體整個(gè)過程均在體外進(jìn)行，不經(jīng)過大腸桿菌轉(zhuǎn)化步驟，所以能夠構(gòu)建高容量、高質(zhì)量抗體庫，更易于篩選高親和力抗體和采取體外進(jìn)化方法反抗體性質(zhì)進(jìn)行改造。核糖體展示抗體庫技術(shù)代表了抗體工程未來發(fā)展趨勢(shì)。

43抗體工程藥物第43頁抗體44抗體工程藥物第44頁抗體概念定義一：抗原誘導(dǎo)由淋巴細(xì)胞合成和分泌，含有特殊氨基酸序列和結(jié)構(gòu)免疫球蛋白分子(lg)。定義二：能與對(duì)應(yīng)抗原特異性結(jié)合含有免疫功效球蛋白。45抗體工程藥物第45頁人體中主要抗體及性質(zhì)?byBruceAlberts,AlexanderJohnson,JulianLewis,MartinRaff,KeithRoberts,andPeterWalter.46抗體工程藥物第46頁抗原

抗體由抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生，抗原是抗體藥品靶分子?？贵w所針正確抗原可包含：半抗原。蛋白如糖蛋白或脂蛋白。多糖如脂多糖。人體疾病相關(guān)基因及其編碼蛋白。各種病原體如病毒、支原體、細(xì)菌、原蟲、寄生蟲。47抗體工程藥物第47頁抗體主要作用結(jié)合抗原中和毒素促進(jìn)吞噬功效48抗體工程藥物第48頁結(jié)合抗原和中和毒素?byBruceAlberts,AlexanderJohnson,JulianLewis,MartinRaff,KeithRoberts,andPeterWalter.49抗體工程藥物第49頁促進(jìn)吞噬功效50抗體工程藥物第50頁自然界中可作為抗原物質(zhì)數(shù)不勝數(shù)，機(jī)體中可產(chǎn)生大量抗體來對(duì)付各種抗原，每個(gè)漿細(xì)胞每秒鐘可分泌多個(gè)抗體，免疫蛋白占血漿總蛋白20％，是血液中豐度最高蛋白。51抗體工程藥物第51頁抗體結(jié)構(gòu)?byBruceAlberts,AlexanderJohnson,JulianLewis,MartinRaff,KeithRoberts,andPeterWalter.52抗體工程藥物第52頁Lg分子是由二硫鍵連接起來約4條（2對(duì)）多肽鏈組成，長(zhǎng)一對(duì)稱為重鏈H，有450-570個(gè)Aa殘基，短一對(duì)稱為輕鏈L，約有214個(gè)Aa殘基。53抗體工程藥物第53頁抗體多樣性-抗體編碼基因較多SourcesfromMolecularCellBiology

9.MolecularStructureofGenesandChromosomes

9.4.FunctionalRearrangementsinChromosomalDNA輕鏈L編碼區(qū)由V、J和C區(qū)組成，其中V、J組成可變區(qū)54抗體工程藥物第54頁抗體多樣性SourcesfromMolecularCellBiology

9.MolecularStructureofGenesandChromosomes

9.4.FunctionalRearrangementsinChromosomalDNA重鏈H編碼區(qū)由V、D、J和C區(qū)組成，其中V、D、J組成可變區(qū)55抗體工程藥物第55頁抗體多樣性Lg分子氨基端L鏈1／2與H鏈1／4區(qū)段氨基端組成及排列次序多變，稱為可變區(qū)（V區(qū)）。Lg分子氨基端L鏈1／2與H鏈3／4區(qū)段氨基端組成及排列比較恒定，稱為恒定區(qū)（C區(qū)）。可變區(qū)中互補(bǔ)決定區(qū)CDR

含有很大變異性，而恒定區(qū)中FR

保守。FR1FR2FR3CDR1CDR2CDR3H2NCOOH56抗體工程藥物第56頁抗體多樣性

SourcesfromMolecularBiologyoftheCell

V.CellsinTheirSocialContext

24.TheAdaptiveImmuneSystem

BCellsandAntibodies恒定區(qū)FR

保守恒定區(qū)57抗體工程藥物第57頁抗體獨(dú)特征編碼重鏈和輕鏈基因重排后，進(jìn)行表示生成細(xì)胞表面受體并能與抗原發(fā)生作用。只有這些Bcell表示表面Lg與一個(gè)外源抗原結(jié)合后才會(huì)引發(fā)深入反應(yīng)。在這些識(shí)別過程中將本身抗原識(shí)別掉排除。識(shí)別外源抗原Bcell被誘導(dǎo)增殖并分泌抗體，在此過程中，可變結(jié)構(gòu)域CDR特定部位被誘導(dǎo)發(fā)生隨機(jī)突變，Bcell在反向于那些與抗原有高親和力突變抗體分泌。這個(gè)過程非常高效，使免疫系統(tǒng)含有產(chǎn)生反抗任何外來分子抗體能力?？勺儏^(qū)這種獨(dú)特裝配方式叫做抗體獨(dú)特征。58抗體工程藥物第58頁抗體多樣性體細(xì)胞突變，B細(xì)胞分化過程中點(diǎn)突變可重復(fù)進(jìn)行，使分化中B細(xì)胞受抗原壓力選擇。體細(xì)胞內(nèi)重組?；蜣D(zhuǎn)換。核苷酸摻入。

59抗體工程藥物第59頁

?byBruceAlberts,AlexanderJohnson,JulianLewis,MartinRaff,KeithRoberts,andPeterWalter抗體多樣性－其它機(jī)制60抗體工程藥物第60頁雜交瘤技術(shù)和單克隆抗體61抗體工程藥物第61頁單克隆抗體概念雜交細(xì)胞：在誘導(dǎo)物作用下同一細(xì)胞或不一樣細(xì)胞間融合，融合細(xì)胞含有雙親本細(xì)胞染色體和全部或部分特征。雜交瘤細(xì)胞：B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后產(chǎn)生雜交細(xì)胞。單克隆抗體：含有分泌抗體能力B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞經(jīng)無性繁殖形成細(xì)胞系分泌產(chǎn)生活性、親和力均相同抗體。62抗體工程藥物第62頁單克隆抗體特點(diǎn)多克隆抗體不足：假陽性、制備困難、產(chǎn)量低。單抗中抗體分子在Aa序列和空間構(gòu)型上均相同。單抗含有高度特異性。產(chǎn)生單抗細(xì)胞系可長(zhǎng)久傳代并保留，可連續(xù)生產(chǎn)同一性質(zhì)抗體。63抗體工程藥物第63頁制備針對(duì)特異抗原單克隆抗體制備抗原凡含有抗原性物質(zhì)均可免疫時(shí)抗原純度可不高純度高抗原利于以后篩選骨髓瘤細(xì)胞慣用骨髓瘤細(xì)胞系小鼠BALB/c細(xì)胞系大鼠Lou細(xì)胞系免疫動(dòng)物應(yīng)與骨髓瘤細(xì)胞供體相一致64抗體工程藥物第64頁制備針對(duì)特異抗原單克隆抗體普通選40-50%PEG進(jìn)行誘導(dǎo)。細(xì)胞融合后培養(yǎng)液中有脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤、脾、瘤等細(xì)胞。慣用選擇性培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)基。65抗體工程藥物第65頁制備針對(duì)特異抗原單克隆抗體將經(jīng)融合混合細(xì)胞用HAT培養(yǎng)液懸浮稀釋。普通在含有喂養(yǎng)細(xì)胞96孔板中進(jìn)行。在融合后7d用HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，7-14d用HT培養(yǎng)基培養(yǎng)，14d后用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。66抗體工程藥物第66頁制備針對(duì)特異抗原單克隆抗體選擇培養(yǎng)后，只有雜交瘤細(xì)胞才能生存。但不是全部雜交瘤細(xì)胞均能產(chǎn)生所需抗體。產(chǎn)生特定抗原抗體B細(xì)胞只占全部脾細(xì)胞5％左右。用抗原對(duì)全部小孔培養(yǎng)上清進(jìn)行抗體檢測(cè)，篩出能產(chǎn)生目標(biāo)抗體雜交瘤細(xì)胞。67抗體工程藥物第67頁制備針對(duì)特異抗原單克隆抗體將能產(chǎn)生目標(biāo)抗體培養(yǎng)小孔中雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行稀釋?？捎糜邢尴♂尫ê蛙洯傊?。有效稀釋時(shí)，將細(xì)胞稀釋液分加到96孔板中，使每個(gè)小孔在理論上只有一個(gè)細(xì)胞。軟瓊脂法。68抗體工程藥物第68頁制備針對(duì)特異抗原單克隆抗體培養(yǎng)后，取上清進(jìn)行抗體檢測(cè)，取得能產(chǎn)生目標(biāo)抗體雜交瘤細(xì)胞系。大量生產(chǎn)目標(biāo)單克隆抗體。體外培養(yǎng)法，10μg/ml。動(dòng)物體內(nèi)誘生法，5-20mg/ml。69抗體工程藥物第69頁小結(jié)1.用特定抗原免疫動(dòng)物2.從脾中取出B淋巴細(xì)胞2.骨髓瘤細(xì)胞3.取得雜交瘤細(xì)胞4.培養(yǎng)并篩選能產(chǎn)生抗體單個(gè)雜交瘤細(xì)胞5.優(yōu)化培養(yǎng)目標(biāo)雜交瘤細(xì)胞6.純化單克隆抗體70抗體工程藥物第70頁單克隆抗體不足當(dāng)前單克隆抗體均是鼠源性抗體，應(yīng)用于人體內(nèi)可產(chǎn)生人抗鼠抗體（humanantimouseantibody,HAMA)人體排斥反應(yīng)人體內(nèi)半衰期只有5-6小時(shí)抵達(dá)靶組織藥量?jī)H有1％完整抗體分子相對(duì)分子量較大，穿透力不強(qiáng)，難以抵達(dá)病灶關(guān)鍵部位71抗體工程藥物第71頁基因工程抗體72抗體工程藥物第72頁基因工程改造抗體目標(biāo)降低免疫原性。降低相對(duì)分子量，增加穿透力。73抗體工程藥物第73頁人－鼠嵌合抗體(human-mousechimericantibody)在基因水平上將鼠源性單克隆抗體可變區(qū)和人源性抗體恒定區(qū)連接起來，并在適當(dāng)宿主細(xì)胞中表示形成抗體。74抗體工程藥物第74頁人－鼠嵌合抗體鼠源性鼠源性人源性人源性75抗體工程藥物第75頁人－鼠嵌合抗體構(gòu)建能產(chǎn)生目標(biāo)抗體雜交瘤細(xì)胞系mRNAcDNA依據(jù)VL和VH基因兩端序列設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增VH基因VL基因連人IgCH基因連人IgCL基因等量混合后，經(jīng)過脂質(zhì)體介導(dǎo)共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞SP2/0,篩選取得共轉(zhuǎn)染細(xì)胞76抗體工程藥物第76頁人－鼠嵌合抗體不足

即使人－鼠嵌合抗體與鼠源性抗體相比，在一定程度上減弱了人抗鼠抗體反應(yīng)，但仍不能完全消除。77抗體工程藥物第77頁抗體CDR區(qū)

SourcesfromMolecularBiologyoftheCell

V.CellsinTheirSocialContext

24.TheAdaptiveImmuneSystem

BCellsandAntibodies框架區(qū)框架區(qū)CDR78抗體工程藥物第78頁

改形抗體又叫CDR移植抗體。將鼠單抗CDR移植到人Ig分子骨架區(qū)中，換下其CDR序列而形成抗體。改形抗體(reshapedantibody)79抗體工程藥物第79頁含有鼠源性單克隆抗體抗原結(jié)合特異性。抗體分子中鼠源部分只占很小百分比，可基本消除免疫原性。到當(dāng)前，約有100種鼠單抗經(jīng)過CDR移植取得人源化改形抗體，其中超出40種已進(jìn)行或正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。改形抗體特點(diǎn)80抗體工程藥物第80頁構(gòu)建改形抗體除較復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)勁外，最大問題是人Ig分子框架區(qū)中一些氨基酸與鼠單抗CDR區(qū)不協(xié)調(diào)，從而使改形抗體親和力下降，甚至喪失活性。改形抗體不足81抗體工程藥物第81頁在人－鼠嵌合抗體基礎(chǔ)上，未來自鼠單抗可變區(qū)中決定免疫原性暴露于抗體表面Aa，用對(duì)應(yīng)位置人IgAa代替而形成抗體。鑲面抗體（resurfacingantibody）82抗體工程藥物第82頁1991年，Padlan等分析了大量鼠單抗可變區(qū)Aa和人抗體可變區(qū)Aa表面暴露情況，發(fā)覺抗體表面所暴露Aa位置和數(shù)量都很保守，不因種屬和型別而改變。抗體表面暴露Aa是鼠源可變區(qū)免疫源性主要起源。鑲面抗體理論基礎(chǔ)83抗體工程藥物第83頁FcFdFabFv小分子抗體84抗體工程藥物第84頁Fab片段和重組Fab片段Fab片段由重鏈Fd段和完整輕鏈經(jīng)過鏈間二硫鍵形成異二聚體，整個(gè)分子約占整個(gè)抗體分子1/3。假如Fab片段恒定區(qū)為人源性，則稱為重組Fab片段。S－SVLCLVHCH85抗體工程藥物第85頁小分子抗體－抗體片段化Fab:Fragmentationofantigenbinding胃蛋白酶木瓜蛋白酶86抗體工程藥物第86頁Fv和單鏈抗體(single-chainFv,scFv)Fv片段由重鏈可變區(qū)VH段和輕鏈可變區(qū)VL經(jīng)過非共價(jià)鍵結(jié)合在一起，是抗體中含有抗原結(jié)合活性最小功效片段。scFv是指在DNA水平上用一段長(zhǎng)度適當(dāng)寡核苷酸序列將重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)連接起來，形成單一鏈分子。VLVHVLVHVLVH87抗體工程藥物第87頁雙體分子(diabody)

一條單鏈抗體分子上VH和VL與另一條相同單鏈抗體分子上VL和VH分別配對(duì)形成雙價(jià)抗體分子。VLVHVHVL88抗體工程藥物第88頁單域抗體

比Fv更小亞單位結(jié)構(gòu)組成含有抗原結(jié)合活性分子，重鏈可變區(qū)是經(jīng)典單域抗體，其含有較高抗原結(jié)合活性。VH89抗體工程藥物第89頁最小識(shí)別單位比單域抗體更小分子，如CDR3仍能與抗原結(jié)合，只是其親和力相當(dāng)?shù)?。CDR390抗體工程藥物第90頁小分子抗體優(yōu)點(diǎn)分子質(zhì)量小，免疫原性低。易于進(jìn)入實(shí)體瘤周圍微循環(huán)甚至進(jìn)入實(shí)體瘤內(nèi)部。無Fc片段，不易與含有Fc受體非靶細(xì)胞結(jié)合，用于免疫診療時(shí)成像清楚。構(gòu)建較簡(jiǎn)單，易于操作和改造?？稍诩?xì)菌中表示，易于大量生產(chǎn)?？膳c各種效應(yīng)分子如毒素、前體藥品轉(zhuǎn)化酶等構(gòu)建各種雙功效抗體分子。91抗體工程藥物第91頁小分子抗體缺點(diǎn)多為單價(jià)抗體，與抗原結(jié)合活性相對(duì)較弱。半衰期短，能很快從血液中去除，從而可能影響治療有效濃度。92抗體工程藥物第92頁抗體庫技術(shù)(antibodylibrary)用基因克隆技術(shù)克隆全套抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，然后重組到特定表示載體中，轉(zhuǎn)化特定