H5N1亞型禽流感病毒感染性克隆的構(gòu)建

匯報(bào)提綱：文獻(xiàn)綜述RNA干擾對(duì)A型流感病毒基因表達(dá)及病毒復(fù)制的抑制作用的研究H5N1亞型禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004全基因組克隆、測(cè)序及其感染性克隆的構(gòu)建

現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日1文獻(xiàn)綜述

文獻(xiàn)綜述現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日禽流感的發(fā)生與流行

文獻(xiàn)綜述禽流感（AvianInfluenza,AI），是由A型流感病毒引起的一種禽類的烈性傳染性疾病或疾病綜合征。1878年，首次在意大利發(fā)現(xiàn)了禽流感的流行。高致病性禽流感（HighlyPathogenicAvianInfluenza,HPAI）是由A型流感病毒中H5、H7亞型流感病毒引起，目前已經(jīng)呈世界性分布，全世界50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)（OIE數(shù)據(jù)）報(bào)道了高致病性禽流感的發(fā)生和流行。我國(guó)自1996年首次報(bào)道分離到H5N1亞型高致病性禽流感病毒之后，其流行一直呈上升趨勢(shì)?，F(xiàn)在是3頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日世界上高致病性禽流感感染人的發(fā)病與死亡情況（截至2006-6-03）

文獻(xiàn)綜述現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日禽流感病毒的結(jié)構(gòu)模式圖

文獻(xiàn)綜述

流感病毒為單股負(fù)鏈RNA，由8個(gè)片斷組成，共編碼8種結(jié)構(gòu)蛋白和2種非結(jié)構(gòu)蛋白。其表面有一層由雙層脂質(zhì)構(gòu)成的囊膜，鑲嵌著二種重要的纖突，分別為HA、NA。病毒粒子的主要蛋白成分：?血凝素（HA）?神經(jīng)氨酸（NA）?核蛋白（NP）?基質(zhì)蛋白(M1,M2)?聚合酶（PB1、PB2、PA）?非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2）現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日1995年康奈爾大學(xué)GuoSu博士試圖（1995）用反義RNA去阻斷秀麗新小桿線蟲（C.elegans）中的par1基因的表達(dá)時(shí),意外發(fā)現(xiàn)給對(duì)照實(shí)驗(yàn)組線蟲注射正義RNA，不但不增加該基因的表達(dá)，反而產(chǎn)生與反義RNA同樣的結(jié)果。1998年2月，華盛頓卡耐基研究院的Fire博士和馬薩諸塞大學(xué)癌癥中心的Mello博士才證實(shí)GuoSu博士發(fā)現(xiàn)的正義RNA抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象是由于體外轉(zhuǎn)錄的RNA中污染了少量雙鏈RNA而引起。RNA干擾的歷史研究和發(fā)現(xiàn)過(guò)程

文獻(xiàn)綜述現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日Fire和Mello實(shí)驗(yàn)表明在線蟲消化道中注入雙鏈RNA不但可以阻斷整個(gè)線蟲的同源基因表達(dá)，還會(huì)導(dǎo)致其子一代的同源基因沉默。他們將這一現(xiàn)象首次稱為RNA干擾（RNAinterference，RNAi）。RNA干擾現(xiàn)象隨后在昆蟲、錐蟲、果蠅、渦蟲、斑馬魚、真菌、植物擬南芥等生物及哺乳動(dòng)物細(xì)胞株中也分別被發(fā)現(xiàn)。RNA干擾的歷史研究和發(fā)現(xiàn)過(guò)程

文獻(xiàn)綜述現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日RNA干擾的基本原理

文獻(xiàn)綜述ATP、RNA解旋酶現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日通過(guò)作用于病毒特定基因的siRNA抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，siRNA可作用于細(xì)胞中病毒靶受體以干擾病毒的侵染，期望達(dá)到治療病毒性疾病的目標(biāo)。RNA干擾技術(shù)已經(jīng)在多種病毒研究中得到了成功的應(yīng)用：人類免疫缺陷病毒Ⅰ型、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、甲型流感病毒、口蹄疫病毒、西尼羅病毒和SARS冠狀病毒等。RNAi在病毒研究中的應(yīng)用

文獻(xiàn)綜述現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日病毒的感染性克隆其實(shí)就是模擬病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等病毒生命周期，人工構(gòu)建病毒的過(guò)程。病毒的感染性克隆也稱為病毒的反向遺傳操作技術(shù)（ReverseGeneticManipulaton）。病毒的感染性克隆

文獻(xiàn)綜述現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日反向遺傳學(xué)及其操作技術(shù)反向遺傳學(xué)是直接從生物的遺傳物質(zhì)入手來(lái)闡述生物生命發(fā)生的本質(zhì)現(xiàn)象，與之相關(guān)的各種技術(shù)統(tǒng)稱為反向遺傳學(xué)操作技術(shù)。病毒反向遺傳操作技術(shù)解決了對(duì)RNA病毒基因組難以操作這一困擾研究者多年的難題，開(kāi)創(chuàng)了病毒研究的新時(shí)代。

文獻(xiàn)綜述現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日禽流感病毒的復(fù)制現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日以輔助流感病毒為基礎(chǔ)的反向遺傳操作系統(tǒng)核糖核蛋白轉(zhuǎn)染法RNA聚合酶Ⅰ方法完全以克隆的cDNA為基礎(chǔ)的反向遺傳操作系統(tǒng)RNA聚合酶Ⅰ系統(tǒng):17質(zhì)粒系統(tǒng)RNA聚合酶Ⅰ系統(tǒng):12質(zhì)粒系統(tǒng)雙向RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ轉(zhuǎn)錄系統(tǒng):8質(zhì)粒系統(tǒng)流感病毒反向遺傳操作技術(shù)的發(fā)展歷程

現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日以輔助流感病毒為基礎(chǔ)的反向遺傳操作系統(tǒng)

核糖核蛋白轉(zhuǎn)染法：

采用T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，NS-CAT-NS，體外轉(zhuǎn)錄

RNA聚合酶Ⅰ方法：

RNA聚合酶I（polI）啟動(dòng)子代替T7RNA聚合酶啟動(dòng)子現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日完全以克隆的cDNA為基礎(chǔ)的反向遺傳操作系統(tǒng)

17質(zhì)粒系統(tǒng)

12質(zhì)粒系統(tǒng)

現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日2000年，Hoffmann等建立了RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ系統(tǒng)，vRNA和mRNA的合成來(lái)自于一個(gè)模板，不需要構(gòu)建專門的蛋白表達(dá)質(zhì)粒，為拯救病毒而構(gòu)建的質(zhì)粒數(shù)將大大減少。

這一系統(tǒng)采用共培養(yǎng)的293T細(xì)胞和MDCK細(xì)胞，8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，

RNA聚合酶Ⅰ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生負(fù)鏈vRNA，RNA聚合酶Ⅱ合成正鏈mRNA。轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中產(chǎn)生的病毒隨后將感染MDCK細(xì)胞并大量復(fù)制。RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ轉(zhuǎn)錄系統(tǒng):8質(zhì)粒系統(tǒng)現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ轉(zhuǎn)錄系統(tǒng):8質(zhì)粒系統(tǒng)現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日雙向RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ轉(zhuǎn)錄系統(tǒng):8質(zhì)粒系統(tǒng)現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日利用反向遺傳學(xué)操作技術(shù)研究流感病毒的致病性利用反向遺傳學(xué)操作技術(shù)研究流感病毒的生命周期利用反向遺傳學(xué)操作技術(shù)研究流感疫苗流感病毒反向遺傳操作技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日“6＋2”流感疫苗現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日2RNA干擾對(duì)A型流感病毒基因表達(dá)及病毒

復(fù)制的抑制作用的研究

現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日2.1研究目的和意義本研究選用NP和M2基因作為RNA干擾的靶基因，針對(duì)NP和M2基因保守區(qū)段設(shè)計(jì)了5對(duì)siRNA。研究了siRNA對(duì)基因表達(dá)的影響及其對(duì)H1N1、H5N1和H9N2亞型流感病毒在體內(nèi)和體外復(fù)制的影響，篩選出能有效抑制流感病毒復(fù)制的siRNA序列，為探索RNAi技術(shù)應(yīng)用于抗禽流感研究奠定基礎(chǔ)。

研究目的和意義現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日2.2研究?jī)?nèi)容禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004NP和M2基因的克隆及M2基因跨膜區(qū)的缺失(△M2).NP和△M2基因同eGFP共表達(dá)真核質(zhì)粒的構(gòu)建及其在HeLa細(xì)胞中的表達(dá).NP和△M2基因特異性siRNA的設(shè)計(jì)及其真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建siRNA對(duì)NP和△M2基因在HeLa細(xì)胞中表達(dá)水平影響的研究.siRNA在體外（MDCK細(xì)胞上）對(duì)流感病毒(H5N1,H9N2,H1N1)復(fù)制的影響.siRNA的體內(nèi)試驗(yàn)和攻毒保護(hù)試驗(yàn)研究?jī)?nèi)容現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日2.3結(jié)果與分析現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日NP基因的PCR擴(kuò)增及同報(bào)告基因（EGFP）融合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果與分析NP基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果質(zhì)粒pCDM-NP的酶切鑒定和PCR鑒定現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日PCR方法缺失M2基因跨膜區(qū)結(jié)果與分析現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日M2基因的克隆、跨膜區(qū)的缺失及同報(bào)告基因（EGFP）融合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果與分析M2基因跨膜區(qū)缺失的PCR擴(kuò)增結(jié)果質(zhì)粒pCDM-△M2的酶切鑒定和PCR鑒定現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日結(jié)果與分析NP基因同EGFP在HeLa細(xì)胞中的融合表達(dá)△M2基因同EGFP在HeLa細(xì)胞中的融合表達(dá)質(zhì)粒pCDM-NP、pCDM-△M2在轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后12小時(shí)就可以檢測(cè)到特異性熒光，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)發(fā)出熒光的細(xì)胞明顯增多，熒光主要呈彌散性分布于整個(gè)細(xì)胞中，說(shuō)明NP基因與EGFP，△M2基因與EGFP均發(fā)生了融合表達(dá)。NP、△M2基因同報(bào)告基因（EGFP）在HeLa細(xì)胞中的融合表達(dá)現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日NP和△M2基因特異性siRNA的設(shè)計(jì)及其真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建BamHI+HindIII結(jié)果與分析現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日NP和△M2基因特異性siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建siRNA表達(dá)質(zhì)粒bamHI+HindIII的雙酶切鑒定M:DNAmarker(DL-15000)1:pSCMV-M482:pSCMV-M7543:pSCMV-M9494:pSCMV-NP7495:pSCMV-NP1383結(jié)果與分析現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日結(jié)果與分析siRNA表達(dá)質(zhì)粒與pCDM-NP共轉(zhuǎn)染

siRNA表達(dá)質(zhì)粒與pCDM-△M2共轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)質(zhì)粒與pCDM-NP或pCDM-△M2共轉(zhuǎn)染現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日siRNA對(duì)NP和△M2基因在HeLa細(xì)胞中表達(dá)水平影響結(jié)果與分析現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日siRNA表達(dá)質(zhì)粒同pCDM-NP共轉(zhuǎn)染后24h的流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果與分析現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日結(jié)果與分析siRNA表達(dá)質(zhì)粒同pCDM-△M2共轉(zhuǎn)染后24h的流式細(xì)胞檢測(cè)現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日半定量RT-PCR檢測(cè)NP、EGFPmRNA的水平結(jié)果與分析A:pNP-EGFP+pS-NegativeB:pNP-EGFP+pS-NP749C:pNP-EGFP+pS-NP1383D:CellControl現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日結(jié)果與分析A:p△M2-EGFP+pS-NegativeB:p△M2-EGFP+pS-M48C:p△M2-EGFP+pS-M754D:p△M2-EGFP+pS-M949E:CellControl半定量RT-PCR檢測(cè)△M2、EGFPmRNA的水平現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日半定量RT-PCR檢測(cè)看家基因GAPDHmRNA的水平結(jié)果與分析A：pCDM-NP＋pSilencer4.1-negativeB：pCDM-NP＋pSCMV-NP749C：pCDM-NP＋pSCMV-NP1383D：pCDM-△M2＋pSilencer4.1-negativeE：pCDM-△M2＋pSCMV-M48F：pCDM-△M2＋pSCMV-M754G：pCDM-△M2＋pSCMV-M949H：CellControl現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日Westernblot評(píng)價(jià)siRNA對(duì)目的基因表達(dá)的抑制作用結(jié)果與分析Westernblot檢測(cè)△M2基因的表達(dá)水平A：pCDM-△M2＋pSilencer4.1-negativeC：pCDM-△M2＋pSCMV-M754B：pCDM-△M2＋pSCMV-M949D：pCDM-△M2＋pSCMV-M48E：CellControl

Westernblot檢測(cè)NP基因的表達(dá)水平A：pCDM-NP＋pSilencer4.1-negativeC：pCDM-NP＋pSCMV-NP1383B：pCDM-NP＋pSCMV-NP749D：CellControl現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日Westernblot檢測(cè)GAPDH基因的表達(dá)結(jié)果與分析A：pCDM-NP＋pSilencer4.1-negativeE：pCDM-△M2＋pSCMV-M48B：pCDM-NP＋pSCMV-NP749F：pCDM-△M2＋pSCMV-M754C：pCDM-NP＋pSCMV-NP1383G：pCDM-△M2＋pSCMV-M949D：pCDM-△M2＋pSilencer4.1-negativeH：CellControl現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日siRNA對(duì)A型流感病毒在MDCK細(xì)胞中復(fù)制的抑制作用結(jié)果與分析在6孔板上培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%滿時(shí)分別轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)質(zhì)粒，同時(shí)設(shè)置pSilencer4.1-negative對(duì)照和空白細(xì)胞對(duì)照。轉(zhuǎn)染后18-24h分別接種流感病毒H1N1（106TCID50），H5N1（104TCID50），H9N2（106TCID50），接毒后48-72h收獲細(xì)胞及上清進(jìn)行病毒TCID50的測(cè)定?，F(xiàn)在是40頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日siRNA對(duì)A型流感病毒在MDCK細(xì)胞中復(fù)制的抑制作用結(jié)果與分析現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日siRNA對(duì)A型禽流感病毒在小鼠肺中復(fù)制的抑制作用結(jié)果與分析各攻毒組小鼠（4只/組）注射質(zhì)粒的種類和劑量

現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日siRNA對(duì)H5N1亞型禽流感病毒在小鼠肺中復(fù)制的抑制作用結(jié)果與分析

siRNA的瞬時(shí)表達(dá)特異性抑制H5N1亞型禽流感病毒在小鼠肺臟中的復(fù)制

現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日siRNA對(duì)H5N1亞型禽流感病毒在小鼠肺中復(fù)制的抑制作用結(jié)果與分析

siRNA特異性抑制H5N1流感病毒在體內(nèi)的復(fù)制現(xiàn)在是44頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日siRNA對(duì)H1N1和H9N2亞型流感病毒在小鼠肺中復(fù)制的抑制作用結(jié)果與分析siRNA的瞬時(shí)表達(dá)特異性抑制H1N1亞型流感病毒在小鼠肺臟中的復(fù)制siRNA的瞬時(shí)表達(dá)特異性抑制H9N2亞型禽流感病毒在小鼠肺臟中的復(fù)制

現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日siRNA對(duì)H1N1和H9N2亞型流感病毒在小鼠肺中復(fù)制的抑制作用結(jié)果與分析

siRNA顯著性降低H1、H5和H9亞型流感病毒攻擊小鼠的肺病毒滴度現(xiàn)在是46頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日siRNA對(duì)A型流感病毒攻擊小鼠的保護(hù)作用結(jié)果與分析攻毒保護(hù)組小鼠（8只/組）注射質(zhì)粒的種類和劑量

現(xiàn)在是47頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日

siRNA對(duì)H1N1亞型流感病毒攻擊小鼠的保護(hù)作用結(jié)果與分析H1N1亞型流感病毒攻擊后小鼠體重的變化*,Groupsdifferforweightloss,p<0.05(Student’stest)

H1N1亞型流感病毒攻擊后小鼠的存活率

現(xiàn)在是48頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日siRNA對(duì)H5N1亞型禽流感病毒攻擊小鼠的保護(hù)作用結(jié)果與分析H5N1亞型流感病毒攻擊后小鼠體重的變化*,Groupsdifferforweightloss,p<0.05(Student’stest)

H5N1亞型流感病毒攻擊后小鼠的存活率

現(xiàn)在是49頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日2.4討論討論現(xiàn)在是50頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日RNAi的設(shè)計(jì)RNAi具有高度的基因特異性。在發(fā)夾式siRNA中，單個(gè)堿基的錯(cuò)配都可能會(huì)消除它的RNAi效果。因此，構(gòu)建的siRNA表達(dá)質(zhì)粒必須經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定，保證與靶基因的100%同源性。所設(shè)計(jì)的siRNA序列不應(yīng)與人或其它動(dòng)物基因組同源。本研究中，“看家基因”-GAPDH的檢測(cè)結(jié)果顯示：所選擇的siRNA沒(méi)有干擾轉(zhuǎn)染細(xì)胞本身的基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄。討論現(xiàn)在是51頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日NP和M2基因作為RNA干擾的靶基因的意義

NP和M2基因是A型流感病毒中最保守的基因，變異很小，因而選擇NP和M2基因作為RNA干擾的靶基因，這樣找到的能有效抑制流感病毒復(fù)制的siRNA序列對(duì)所有A型流感病毒都是有效的。本研究的結(jié)果也顯示了，能有效抑制NP和M2基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的siRNA對(duì)A型流感病毒中不同亞型的病毒均有抑制作用，說(shuō)明以NP和M2為靶基因設(shè)計(jì)的siRNA對(duì)A型流感病毒的抑制作用具有廣譜性。討論現(xiàn)在是52頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日RNA干擾在抗病毒研究中的應(yīng)用前景

依靠RNAi技術(shù)獲得病毒復(fù)制的強(qiáng)有效抑制的同時(shí)，不得不考慮病毒逃逸的可能性。為避免這個(gè)困難，通常采用多個(gè)必需靶位點(diǎn)作為聯(lián)合siRNA治療方法，以避免病毒逃逸突變株的演化。本研究中采用siRNAM-48+NP-1383聯(lián)合使用時(shí)的效果明顯優(yōu)于二者單獨(dú)使用時(shí)的效果，這可能也是因?yàn)槁?lián)合使用時(shí)針對(duì)的是流感病毒的兩個(gè)基因的靶位點(diǎn)，從而有效地減少了病毒逃逸的可能，增強(qiáng)了治療效果。討論現(xiàn)在是53頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日2.5結(jié)論完成了禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004NP和M2基因的克隆，采用PCR方法缺失了M2基因跨膜區(qū)的第26－55位氨基酸（△M2）。

實(shí)現(xiàn)了NP和△M2基因分別同EGFP在HeLa細(xì)胞中的融合表達(dá)，融合蛋白呈彌散性分布于細(xì)胞漿中。以NP和△M2基因?yàn)榘行蛄校O(shè)計(jì)合成了五個(gè)siRNA，并構(gòu)建了各自的表達(dá)質(zhì)粒。將siRNA表達(dá)質(zhì)粒分別與對(duì)應(yīng)的pCDM-NP和pCDM-△M2共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后，通過(guò)熒光觀察、流式細(xì)胞、半定量RT-PCR和Westernblot等方法檢測(cè)證實(shí)，針對(duì)NP基因設(shè)計(jì)的2個(gè)siRNA均對(duì)NP基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)產(chǎn)生了顯著的抑制作用，針對(duì)△M2基因設(shè)計(jì)的3個(gè)siRNA也均對(duì)△M2基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)產(chǎn)生了顯著的抑制作用?，F(xiàn)在是54頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日2.5結(jié)論設(shè)計(jì)的siRNA抑制流感病毒（H5N1，H9N2，H1N1）在MDCK細(xì)胞上的復(fù)制，其中pSCMV-M48和

pSCMV-NP1383對(duì)流感病毒復(fù)制的抑制作用最強(qiáng)。設(shè)計(jì)的siRNA導(dǎo)入小鼠體內(nèi)能有效降低H5N1，H9N2，H1N1流感病毒感染小鼠的肺病毒滴度，pSCMV-M48和

pSCMV-NP1383聯(lián)合使用時(shí)，攻毒小鼠體重減輕幅度較對(duì)照組小，且能部分保護(hù)小鼠遭受致死性流感病毒的攻擊。

現(xiàn)在是55頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日3H5N1亞型禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004

全基因組克隆、測(cè)序及其感染性克隆的構(gòu)建

現(xiàn)在是56頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日

3.1研究目的和意義本研究針對(duì)2004年春禽流感爆發(fā)流行期間在湖北省家禽感染病料中分離出的一株H5N1禽流感病毒，對(duì)其全基因組進(jìn)行克隆、測(cè)序及遺傳進(jìn)化分析，根據(jù)基因核苷酸序列繪制出了H5N1亞型禽流感病毒基因組系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。目的是揭示H5N1禽流感病毒湖北分離株與其它流感病毒流行株間的親緣關(guān)系及遺傳演化規(guī)律，為高致病性禽流感的預(yù)測(cè)、監(jiān)控、防制提供有力的證據(jù)。研究目的和意義現(xiàn)在是57頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日反向遺傳操作技術(shù)發(fā)展到現(xiàn)在，實(shí)現(xiàn)了使用完全以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的操作系統(tǒng)，因此可以對(duì)病毒基因組方便地操作，顯示了良好的應(yīng)用前景。病毒的反向遺傳操作技術(shù)在深入闡明病毒的生活周期和致病性、基因組的結(jié)構(gòu)與功能、研制基因修飾的疫苗候選株、發(fā)展病毒載體等方面可以廣泛地應(yīng)用。研究目的和意義現(xiàn)在是58頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日3.2研究?jī)?nèi)容H5N1亞型禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004

全基因組克隆、測(cè)序及遺傳進(jìn)化分析用于流感病毒拯救的八個(gè)轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒的構(gòu)建H5N1亞型禽流感病毒湖北分離株的體外拯救拯救病毒的鑒定研究?jī)?nèi)容現(xiàn)在是59頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日3.3結(jié)果與分析現(xiàn)在是60頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日基因組八個(gè)片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果現(xiàn)在是61頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日H5N1亞型禽流感病毒基因序列及遺傳進(jìn)化分析現(xiàn)在是62頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日H5N1亞型禽流感病毒基因序列及遺傳進(jìn)化分析現(xiàn)在是63頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日H5N1亞型禽流感病毒基因序列及遺傳進(jìn)化分析現(xiàn)在是64頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是65頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日全基因組的亞克隆及八質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的構(gòu)建BsmBI&BsaI現(xiàn)在是66頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日流感病毒的拯救SPF雞胚增殖現(xiàn)在是67頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日拯救病毒在SPF雞胚中增殖不同代次的血凝價(jià)

結(jié)果與分析1,5：TheNO.1generationvirustiters2,6：TheNO.2generationvirustiters3,7：TheNO.3generationvirustiters4,8：Negativecontrol現(xiàn)在是68頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日獲救病毒和野毒對(duì)MDCK細(xì)胞病變的比較結(jié)果與分析原始野毒在MDCK細(xì)胞上形成的病變拯救病毒在MDCK細(xì)胞上形成的病變正常的MDCK細(xì)胞對(duì)照現(xiàn)在是69頁(yè)\一共有76頁(yè)\編輯于星期日RT-PCR擴(kuò)增鑒定拯救病毒結(jié)果與分析1DNAmarker(DL15000)2RT-PCRproductofPB2gene3RT-PCRproductofPB1gene4RT-PCRproductofPAgene5RT-PCRproductofHAgene6RT-PCRproductofNPgene7RT-PCRproductofNAgene8RT-PCRproductofMgene9R