石蠟制片技術(shù)

石蠟制片技術(shù)第1頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六三、實(shí)驗(yàn)原理

石蠟切片的原理是利用石蠟的熔點(diǎn)是58C左右和對(duì)不同化學(xué)物質(zhì)溶解性不同，通過透明劑，在石蠟熔點(diǎn)以上，將石蠟滲透進(jìn)入植物組織和細(xì)胞之間，當(dāng)溫度降低到石蠟熔點(diǎn)以下時(shí)，凝結(jié)成固態(tài)固定組織和細(xì)胞以利于切片。第2頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六一、石蠟制片技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)石蠟切片法是一種最常用的顯微制片方法，它的優(yōu)點(diǎn)是可切出大量極薄的連續(xù)切片，且成本教低。石蠟切片技術(shù)適應(yīng)細(xì)胞水平的研究。第3頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

了解石蠟切片的基本原理，掌握石蠟切片的基本過程和制作方法，學(xué)會(huì)制作石蠟切片中一些常用試劑的配制方法，認(rèn)識(shí)石蠟切片的實(shí)用范圍。第4頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六四、實(shí)驗(yàn)器材、試劑

手搖切片機(jī)、展片臺(tái)、溫箱、鑷子、解剖刀、酒精燈、蓋玻片、指形管等。番紅染色液、固綠染色液、FAA固定液、二甲苯、各級(jí)酒精、石蠟、加拿大樹膠、蛋白膠等第5頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六五、石蠟制片的操作流程

（一）取材（二）固定和抽氣（三）脫水、透明及滲蠟（四）包埋（五）修塊、切片和燙片（六）烘干（七）脫蠟、染色、脫水、透明

（八）封片

第6頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六（一）取材

選取經(jīng)過自己設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照和處理的材料，根據(jù)不同的要求，從植物體上選取有代表性的器官或組織，取材力求新鮮，以避免組織發(fā)生死后變化。取材時(shí)要用快刀切割材料，不能擠壓，所取的材料不宜過大，在不影響觀察的情況下應(yīng)盡可能小些，這樣有利于藥劑透入組織和細(xì)胞中。第7頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六（二）固定和抽氣（一）將切取的植物材料放入固定液中，使其細(xì)胞原生質(zhì)在極短的時(shí)間內(nèi)停止生命活動(dòng)，盡量保持細(xì)胞原有的細(xì)微結(jié)構(gòu)，也可使某些柔軟的材料適當(dāng)硬化，便于切片。材料的長(zhǎng)和寬最大不超過1cm。固定液為材料的20倍左右。固定時(shí)間24小時(shí)，其間要放入抽真空機(jī)中抽氣15-30分鐘至材料完全沉浸在固定液下面。并用鉛筆寫好標(biāo)簽。第8頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六固定劑的種類1.福爾馬林—醋酸—酒精固定劑（FAA）70%或50%酒精90CC冰醋酸5CC福爾馬林5CC2.醋酸—酒精固定劑（卡諾固定劑）此固定劑的主要成分是冰醋酸和純酒精，也可加入氯仿。純酒精（95%酒精）3份冰醋酸1份第9頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六（三）脫水、透明及滲蠟

將材料從固定液中取出后，其具體流程如下：A：酒精X：二甲苯70%A（2h）→85%A（2h）→95%A（2h）→100%A（2h）→100%A（2h）→3/4A+1/4X（2h）→1/2A+1/2X（2-3h、過夜）→1/4A+3/4X（2h）→X（2h）→1/2X+1/2蠟（過夜）→滲蠟1（2h）→滲蠟2（2h）→滲蠟3（2h）第10頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六（四）包埋將滲蠟后的材料和石蠟一起倒入小紙盒，用加熱的鑷子迅速把材料按需要的切面和一定的間隔排列整齊并使其豎直，倒入純蠟進(jìn)行包埋。稍微凝固后倒置于清水盆中徹底冷卻凝固。第11頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六（五）修塊、切片和燙片

1、修塊將包埋好的材料切割成小塊，每個(gè)小塊包含一個(gè)材料，并修成梯形，切面在梯形的上部。注意上部矩形對(duì)邊平行，梯形底部用燒熱的蠟將其固定在木塊上。2、切片將粘有蠟塊的小木塊至于切片機(jī)上，調(diào)整切距到適當(dāng)大小，轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)節(jié)器條切片厚度12μm左右進(jìn)行切片。注意切片時(shí)要一手轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)，另一手執(zhí)毛筆將切下來的片子攤開以形成一長(zhǎng)條蠟帶。3、燙片滴一滴蛋白膠于干凈載玻片中央，用干凈的手指涂抹均勻后，滴上清水，將取下的蠟帶切成小段置于載玻片上（放上兩至三段），然后將載玻片放到展片臺(tái)上(保持40℃)燙片。待充分燙平后用吸水紙吸去多余的水。第12頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六（六）烘干

將燙好的片子自然烘干，或45℃烤片箱干燥1~2天，注意防塵。

第13頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六（七）脫蠟、染色、脫水、透明將玻片標(biāo)本放于100%X（15-30min)→100%X(1-2min)→50%X+50%A(1-2min)→100%A(1-2min)→95%A(1-2min)→85%A(1-2min)→番紅（85%A配制）(2-4h)→85%A(3-5s）→95%A(3-5s）→固綠（100%A配制）(30s)→95%A(1-2min)→100%A(1-2min)→100%A(1-2min）→50%X+50%A(1-2min)→100%X(1-2min)→100%X(1-2min)注意番紅染色時(shí)間要長(zhǎng)些（至少3h以上），隨后的兩次經(jīng)過酒精的時(shí)間都應(yīng)很短，以免洗掉染上的番紅，固綠的染色時(shí)間大約在20-30s,其他各步的時(shí)間大約1至2分鐘，均要視具體情況而定。第14頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六番紅—固綠染色法此法應(yīng)用甚廣，是研究植物一般形態(tài)結(jié)構(gòu)的重要方法。番紅為堿性染料，常用的是混合物（二甲基酚番紅，三甲基酚番紅），可將細(xì)胞核、染色體、核仁等染成紅色，對(duì)木化、栓化、角化的細(xì)胞壁也有很好的染色效果。固綠為酸性染料，能對(duì)細(xì)胞質(zhì)、纖維素細(xì)胞壁染色。番紅與固綠對(duì)染，效果很好。第15頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六番紅染液配法配方藥品III

III

IV番紅1g1g1g1g蒸餾水100cc5%酒精95cc70%酒精100cc95cc苯胺油5cc5cc第16頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六

固綠染液配法配方藥品

I

II

III

IV

V

VI固綠0.5-1g0.5-1g0.5-1g0.5-1g0.3-0.5g1-2g95%酒精100cc無水酒精100cc50-60cc95cc80cc苯胺油5cc20cc丁香油100cc40-50cc第17頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六鐵礬—蘇木精染色法次法在細(xì)胞學(xué)及胚胎學(xué)上廣為應(yīng)用，是顯示細(xì)胞一般結(jié)構(gòu)及細(xì)胞分裂的良好染色方法，它能將細(xì)胞核、細(xì)胞分裂時(shí)的染色體染成藍(lán)黑色，且能長(zhǎng)久保持顏色。蘇木精（C16H14O6）不能直接染色，必須氧化成熟為氧化蘇木精，同時(shí)還要經(jīng)過媒劑的作用，才能染上顏色，所以這種染色法必須配制兩種溶液。第18頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六染液的配制甲液：4%鐵礬（硫酸鐵胺）水溶液，這是一種媒染劑，沖淡成2%的濃度時(shí)，又可作分色劑使用，臨用時(shí)配用較好。乙液：蘇木精10g+無水酒精100CC，這是母液，要經(jīng)1—2個(gè)月才能氧化成熟，染色時(shí)，將此母液5CC加入100CC蒸餾水，沖淡應(yīng)用。第19頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六染色過程玻片材料經(jīng)脫蠟、各級(jí)酒精、蒸餾水，進(jìn)入4%鐵礬媒染05—4小時(shí)，水洗約5分鐘，換蒸餾水2次，每次2—3分鐘，然后05%蘇木精染色1—4小時(shí)或更長(zhǎng)，蒸餾水換洗數(shù)次，再用2%鐵礬分色，一般大約半分鐘至數(shù)分鐘。在分色時(shí)，要隨時(shí)在低倍鏡下檢查，直到滿意為止。然后，用水沖洗30分鐘，最后換蒸餾水?dāng)?shù)分鐘。第20頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六（八）封片、干燥、貼標(biāo)簽

1、從二甲苯中取出然好色的片子，用中性樹膠進(jìn)行封片。注意封片用的該玻片要清潔，封片時(shí)要注意不要產(chǎn)生氣泡。2、一般一個(gè)月以上，樹膠才能干燥，如加熱烤片，可縮短干片時(shí)間，在