乳酸脫氫酶活力測(cè)定

乳酸脫氫酶活力測(cè)定第1頁，共12頁，2023年，2月20日，星期日目的要求（1）學(xué)習(xí)LDH活力測(cè)定原理；（2）測(cè)定動(dòng)物肌肉組織提取液LDH活力及比活力。第2頁，共12頁，2023年，2月20日，星期日原理乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，簡稱LDH）廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物細(xì)胞內(nèi)，是糖代謝酵解途徑的關(guān)鍵酶之一，可催化如下反應(yīng)：

LDH乳酸+NAD+

丙酮酸+NADH+H+pH7.4-7.8第3頁，共12頁，2023年，2月20日，星期日LDH可溶于水或稀鹽溶液，可制備組織勻漿，經(jīng)浸泡、離心，得上清為組織提取液。LDH測(cè)定方法很多，紫外分光光度法最為簡便快速。鑒于NADH和NAD+在340nm和260nm處有各自最大吸收峰值，因此以NAD+為輔酶的各種脫氫酶類都可通過340nm光吸收值的改變，定量測(cè)定酶的含量。本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)液中含丙酮酸及NADH，在一定條件下加入一定量酶液，觀察NADH在反應(yīng)過程中340nm處光吸收減少值，減少越多，則LDH活力越高。其活力單位定義為：在25℃，pH7.5條件下A340nm/min下降為1.0的酶量為1個(gè)單位。可定量測(cè)定每克濕重組織中LDH單位，定量測(cè)定蛋白質(zhì)含量即可計(jì)算比活力（U/mg）。第4頁，共12頁，2023年，2月20日，星期日試劑與器材材料：動(dòng)物的肌肉、肝、心、腎等組織。勻漿緩沖液：10mmol/LpH6.5磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液。酶活力測(cè)定試劑：（1）0.1mol/LpH7.5磷酸緩沖液(PB)100ml；（2）NADH溶液：3.5mg純NADH以0.1mol/LpH7.5PB1ml稀釋。（3）丙酮酸溶液：2.5mg丙酮酸鈉，以以0.1mol/LpH7.5PB29ml稀釋。試劑（2）（3）最好在臨用前配制。第5頁，共12頁，2023年，2月20日，星期日操作方法（一）制備肌肉勻漿（二）LDH活力測(cè)定（三）蛋白質(zhì)含量測(cè)定（四）數(shù)據(jù)處理第6頁，共12頁，2023年，2月20日，星期日（一）制備肌肉勻漿取瘦豬肉（或兔肉）一塊除去脂肪及筋膜等，稱取20g，按W/V=1/4比例加入4℃預(yù)冷的10mmol/LpH6.5磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液，用組織搗碎機(jī)搗碎，每次10s，連續(xù)3次。將勻漿液倒至燒杯中，置4℃冰箱提取過夜，過濾后的紅色液體為組織提取液，量總體積。第7頁，共12頁，2023年，2月20日，星期日（二）LDH活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)時(shí)預(yù)先將丙酮酸溶液及NADH溶液放在25℃水浴中預(yù)熱。取2只光徑為1cm的石英比色皿，在一只比色皿中加入0.1mol/LpH7.5磷酸鹽緩沖液3ml，置紫外分光光度計(jì)中，于340nm處調(diào)A值為0；另一只比色皿用于測(cè)定LDH活力，依次加入2.9ml丙酮酸溶液、0.1mlNADH溶液，加蓋搖勻后測(cè)定A340nm，然后加入經(jīng)稀釋（20倍）的酶液10μl，立即計(jì)時(shí)，每隔0.5min測(cè)A340nm，連續(xù)測(cè)定3min。以A對(duì)時(shí)間作圖，取最初線性部分，計(jì)算ΔA340nm/min減少值。第8頁，共12頁，2023年，2月20日，星期日（三）蛋白質(zhì)含量測(cè)定將組織提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)（約1：20），取0.1ml按Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。第9頁，共12頁，2023年，2月20日，星期日（四）數(shù)據(jù)處理每毫升組織提取液中LDH活力單位：LDH比活力總LDH活力（U）比活力（U/mg）=————————————

總蛋白含量（mg）

ΔA340nm/min×稀釋倍數(shù)LDH活力單位（U）/ml提取液=————————————————

酶液加入量（10μl）×10-3提取液中LDH總活力單位=LDH活力（U）/ml×總體積第10頁，共12頁，2023年，2月20日，星期日注意事項(xiàng)1、實(shí)驗(yàn)材料應(yīng)盡量新鮮，如取材后不立即用，應(yīng)貯存在-20℃低溫冰箱中。2、酶液的稀釋度及加入量應(yīng)控制A340/nm下降在0.1-0.2之間，以減少實(shí)驗(yàn)誤差，加入酶液后應(yīng)立即計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確記錄每隔0.5minA340下降值。3、NADH溶液應(yīng)在臨用前配制，如其純度為75%，則應(yīng)折合到100%，增加試劑的稱量