糖皮質(zhì)激素注射后大鼠骨量的變化分析,病理學(xué)論文

糖皮質(zhì)激素注射后大鼠骨量的變化分析,病理學(xué)論文雌激素的缺乏和糖皮質(zhì)激素的使用是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的常見(jiàn)原因。去卵巢致骨質(zhì)疏松癥大鼠模型相對(duì)成熟，而對(duì)于糖皮質(zhì)激素注射后大鼠骨量的變化并沒(méi)有構(gòu)成共鳴。本研究應(yīng)用先進(jìn)的QDＲ4500A型扇形束雙能X線測(cè)定骨密度儀(DXA)測(cè)量糖皮質(zhì)激素注射后大鼠的全身、離體腰椎、離體股骨和脛骨及其興趣區(qū)的骨密度(BMD)、骨礦含量(BMC)、骨骼面積(Area)，以去卵巢大鼠組作為陽(yáng)性對(duì)照，以假手術(shù)+未注射糖皮質(zhì)激素大鼠組作為陰性對(duì)照，討論其在模型中的價(jià)值和骨丟失的情況。1實(shí)驗(yàn)對(duì)象和方式方法1.1大鼠分組和模型的建立42周齡雌性SD大鼠21只(購(gòu)自中南大學(xué)動(dòng)物學(xué)部SCXK2006-0002)，平均體重367g。飼養(yǎng)在22℃～25℃，每日12h光照，12h黑暗的環(huán)境中，任意進(jìn)食中南大學(xué)動(dòng)物學(xué)部自產(chǎn)大鼠全價(jià)顆粒飼料(含1.53%鈣、0.9%磷)和自來(lái)水。適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，隨機(jī)分成3組:假手術(shù)+未注射糖皮質(zhì)激素組(SHAM)、去卵巢組(OVX)、注射甲基強(qiáng)的松龍組(PＲED)。OVX組:3%戊巴比妥鈉按0.1ml/100g體重腹腔注射麻醉大鼠滿意后，取背部正中切口，切開(kāi)皮膚皮下并向兩側(cè)游離皮下組織，在左側(cè)肋下旁開(kāi)中線1橫指處剪開(kāi)肌肉和腹膜，在腹腔脂肪中找到并切除左側(cè)卵巢組織，右側(cè)操作同左側(cè)，逐層縫合并撒青霉素粉劑;SHAM組手術(shù)操作步驟一樣但僅切除與卵巢組織大小類似的腹腔脂肪組織;PＲED組每日皮下注射甲基強(qiáng)的松龍2.5mg/kg(PfizerManufacturingBelgium，NV)。1.2DXA掃描1.2.1全身DXA掃描:分別于術(shù)前(0周)、術(shù)后4周、術(shù)后8周、處死前(12周)應(yīng)用QDＲ4500A型扇形束DXA(Hologic，US)掃描大鼠并用附帶小動(dòng)物軟件進(jìn)行分析。掃描前用人體腰椎體模和小動(dòng)物階梯模型校正。將大鼠麻醉后，取俯臥位行全身掃描，該儀器測(cè)定大鼠全身BMD的批內(nèi)CV為0.71%。1.2.2離體骨DXA掃描:術(shù)后12周，行全身DXA掃描后，處死所有大鼠。取出子宮后，用電子天平(湖南湘儀廠)稱重。取出雙側(cè)股骨、雙側(cè)脛骨、腰椎(L4-L6)，仔細(xì)剝離附著的肌肉和結(jié)締組織并分離腰椎，對(duì)其行高清楚明晰度掃描。按股骨和脛骨測(cè)量圖像的長(zhǎng)度，將其等分成7個(gè)區(qū)(Ｒ1～Ｒ7)，各區(qū)被稱為感興趣區(qū)(ＲOI)，分別測(cè)量各區(qū)的BMD、BMC、Area，此分析方式方法是將各骨骼富含松質(zhì)骨或皮質(zhì)骨的成分相對(duì)劃區(qū)，并基于松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨兩者在骨代謝上的差異，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)骨丟失的敏感區(qū)域。脛骨由近端向遠(yuǎn)端依次劃分，股骨由遠(yuǎn)端向近端依次劃分(圖1)。1.3壓縮試驗(yàn)壓縮試驗(yàn)是骨生物力學(xué)試驗(yàn)中較為重要的一種。完成離體骨DXA掃描后，用慢速鋸(Buehler公司，美國(guó))除去第二腰附件和椎間盤，將圓柱形的腰椎椎體置于力學(xué)試驗(yàn)機(jī)(CSS44100，長(zhǎng)春機(jī)械科學(xué)研究院有限公司)的壓縮工作臺(tái)中心位置上，驅(qū)動(dòng)機(jī)器以2mm/min的實(shí)驗(yàn)速度對(duì)試樣施加壓應(yīng)力，直至腰椎椎體毀壞。連續(xù)記錄載荷應(yīng)變曲線(Load-deformationCurves)并計(jì)算出最大載荷(maximumloading，ML)和彈性模量(elasticmodulus，EM)。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各指標(biāo)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(x珋s)表示，組間均數(shù)先進(jìn)行2正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，若符合正態(tài)分布和方差齊性，則采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，多重比擬再采用LSD-t檢驗(yàn)。若不符合正態(tài)分布和方差不齊性，則采用多重秩和檢驗(yàn)，多重比擬用Mann-Whiteney法，P＜0.05表示差異有顯著性。2結(jié)果2.1術(shù)后12周子宮重量術(shù)后12周SHAM組子宮重量(65451)mg，OVX組子宮重量(1329)mg，約是SHAM組的0.20倍，PＲED組子宮重量為(61360)mg。與SHAM組比擬，OVX組子宮重量非常顯著降低(P＜0.01)，PＲED組與SHAM組之間無(wú)差異顯著性。2.2大鼠全身DXA掃描結(jié)果表1顯示了3組大鼠在術(shù)前(0周)、術(shù)后4周、術(shù)后8周、處死前(12周)不同時(shí)期的體重、BMD、BMC、Area的變化情況。SHAM組大鼠體重增長(zhǎng)緩慢，在術(shù)后4周、8周、12周時(shí)較0周分別增長(zhǎng)了1.80%、4.63%、7.46%。大鼠在去除卵巢后體重迅速增加，在4周、8周、12周時(shí)較0周分別增長(zhǎng)了13.90%、22.19%、28.07%，從第8周開(kāi)場(chǎng)體重顯著重于同時(shí)期的SHAM組大鼠(8周時(shí)P＜0.05，12周時(shí)P＜0.01)。大鼠在皮下注射甲基強(qiáng)的松龍后體重迅速減輕，在4周、8周、12周時(shí)較0周分別減輕了7.31%、9.14%、8.09%，從第4周開(kāi)場(chǎng)體重顯著輕于同時(shí)期的SHAM組大鼠(P＜0.05)，非常顯著輕于同時(shí)期OVX組大鼠(P＜0.01)。固然OVX組大鼠骨骼面積有逐步增加的趨勢(shì)，但是同時(shí)期各組大鼠BMD、Area之間無(wú)差異顯著性，OVX組大鼠BMC在第12周時(shí)顯著高于同時(shí)期SHAM組大鼠(P＜0.05)，在第8、12周時(shí)顯著高于PＲED組大鼠(P＜0.05)。2.3離體骨DXA掃描結(jié)果2.3.1離體腰椎DXA掃描結(jié)果(表2):與SHAM組比擬，OVX組第5、6腰椎BMD顯著降低(P＜0.05)，降低幅度分別為10.28%、11.49%，第6腰椎BMC亦顯著降低(P＜0.05)。PＲED組與SHAM組比擬，BMD、BMC、AＲEA均無(wú)明顯差異。OVX組第5、6腰椎BMD、第6腰椎BMC、Area亦顯著低于PＲED組。2.3.2離體股骨和脛骨DXA掃描結(jié)果(表3、表4):與SHAM組比擬，大鼠去卵巢12周后整體股骨及其遠(yuǎn)端(FＲOI-1、2)和近端(FＲOI-6、7)各兩個(gè)區(qū)域、脛骨近端一個(gè)區(qū)域(TＲOI-1)BMD顯著丟失，華而不實(shí)以松質(zhì)骨組成占優(yōu)勢(shì)的TＲOI-1(-11.40%)和FＲOI-2(-10.85%)骨丟失率最大，股骨中段(FＲOI-3～5)和整體脛骨及華而不實(shí)段(TＲOI-2～4)部分區(qū)域BMD無(wú)顯著性變化，以皮質(zhì)骨組成占優(yōu)勢(shì)的脛骨中遠(yuǎn)段TＲOI-5(7.85%)和TＲOI-6(8.65%)BMD顯著增加。去卵巢后整體股骨及其遠(yuǎn)端(FＲOI-2)、脛骨近端一個(gè)區(qū)域(TＲOI-1)BMC顯著減少，而骨面積無(wú)顯著變化。與SHAM組比擬，甲基強(qiáng)的松龍注射大鼠12周后整體股骨和股骨各個(gè)感興趣區(qū)的BMD、BMC、AＲEA無(wú)顯著性差異，整體脛骨和脛骨各個(gè)感興趣區(qū)BMD無(wú)顯著性差異，脛骨中遠(yuǎn)段(TＲOI-5、6)BMC、AＲEA顯著性增加。2.4骨生物力學(xué)指標(biāo)變化第二腰椎壓縮試驗(yàn)參數(shù)見(jiàn)表5。OVX組最大載荷與彈性模量顯著低于SHAM組(P＜0.01)，PＲED組最大載荷顯著低于SHAM組(P＜0.05)，OVX組與PＲED組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3討論當(dāng)前，骨質(zhì)疏松癥日益增加，雌激素的缺乏和糖皮質(zhì)激素的使用分別是原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的最常見(jiàn)病因。部分患者由于某些疾病比方哮喘、紅斑狼瘡、腎病綜合癥等需要長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素，成人口服強(qiáng)的松6個(gè)月將導(dǎo)致腰椎骨量下降5%～15%并使骨折風(fēng)險(xiǎn)增加。大鼠是研究骨質(zhì)疏松癥的常用模型動(dòng)物之一，但是現(xiàn)有研究對(duì)于大鼠接受糖皮質(zhì)激素后骨量的變化并沒(méi)有一致結(jié)論。有研究表示清楚，甲基強(qiáng)的松龍能增加5周齡大鼠脛骨干骺端BMD，降低8周齡大鼠脛骨干和32周齡大鼠腰椎的BMD。HulleyPA等給3.5月齡大鼠皮下注射甲基強(qiáng)的松龍3.5mg/(kgd)，9周后發(fā)現(xiàn)股骨BMD顯著下降。FerrettiJL等應(yīng)用肢端定量CT(pQCT)分別分析皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨BMD，發(fā)現(xiàn)大劑量糖皮質(zhì)激素能降低30日齡股骨骨皮質(zhì)BMD，而McHughNA等卻在7日齡大鼠脛骨骨皮質(zhì)中得出了不一致的結(jié)論。上述研究表示清楚糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的BMD改變與大鼠的年齡和測(cè)定部位顯著相關(guān)。因而，在我們的實(shí)驗(yàn)中，筆者選用44周齡(大于10月齡)成年雌性大鼠，減少了增齡的影響，而且全面測(cè)定各個(gè)部位BMD，排除部位特異性，并且以獲得廣泛共鳴的模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的去卵巢雌性大鼠模型作為陽(yáng)性對(duì)照。我們的研究發(fā)現(xiàn)SHAM組大鼠體重增加緩慢，在56周齡時(shí)僅較44周齡時(shí)增加了7.46%，BMD、BMC等指標(biāo)相對(duì)恒定，表示清楚大鼠成年后增齡對(duì)其骨量無(wú)顯著影響。大鼠接受甲基強(qiáng)的松龍后，與SHAM組比擬其全身骨骼、腰椎、股骨及股骨各區(qū)、脛骨及脛骨各區(qū)(除TＲOI-5、6外)的BMD、BMC、Area指標(biāo)沒(méi)有顯著改變。PＲED組大鼠體重顯著下降，這是由于其導(dǎo)致了肌肉組織萎縮和脂肪重新分布，但是BMD、BMC亦沒(méi)有對(duì)體重減輕產(chǎn)生適應(yīng)性改變，可能是體重下降的程度還缺乏以啟動(dòng)骨重建機(jī)制，在術(shù)后12周時(shí)較術(shù)前僅下降了8.09%。我們?cè)谟^察大鼠活體整體骨量和離體骨整體骨量變化的同時(shí)，對(duì)股骨和脛骨的DXA圖像進(jìn)行連續(xù)性分割，將其等分為7個(gè)區(qū)并分別測(cè)量各區(qū)的BMD、BMC、Area，而不是采用當(dāng)前常用的單個(gè)選取興趣區(qū)的方式方法進(jìn)行觀察。此分析方式方法是將各骨骼富含松質(zhì)骨或皮質(zhì)骨的成分相對(duì)劃區(qū)，能夠?yàn)閜QCT、顯微CT等試驗(yàn)挑選骨丟失敏感區(qū)域。在PＲED組中，無(wú)論是在以松質(zhì)骨構(gòu)造為主的股骨和脛骨的干骺端以及腰椎，還是在以皮質(zhì)骨為主的全身骨骼及股骨干和脛骨干，都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的骨丟失區(qū)域。在陽(yáng)性對(duì)照OVX組，在以松質(zhì)骨構(gòu)造為主的第5、6腰椎，股骨遠(yuǎn)端和近端的干骺端以及脛骨近端干骺端BMD、BMC顯著下降，這與以往研究相一致，而且我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)以皮質(zhì)骨構(gòu)造占優(yōu)的全身骨骼BMC逐步增加，在12周時(shí)與SHAM組比擬出現(xiàn)顯著性差異，但整體骨骼面積亦有增加的趨勢(shì)，進(jìn)而導(dǎo)致BMD無(wú)明顯變化，這提示當(dāng)組間體重增減不平衡時(shí)，BMC或者BMD單獨(dú)評(píng)價(jià)骨量的改變是不全面的。本實(shí)驗(yàn)中，與SHAM組比擬，OVX組和PＲED組大鼠離體脛骨干及華而不實(shí)遠(yuǎn)端部分區(qū)域骨量顯著增加，其詳細(xì)機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。大鼠接受甲基強(qiáng)的松龍注射后，生物力學(xué)試驗(yàn)中最大載荷顯著下降，彈性模量也有下降趨勢(shì)，但是骨量并不能解釋生物力學(xué)性能的改變，這提示糖皮質(zhì)激素更多的是引起骨質(zhì)量的改變而導(dǎo)致了力學(xué)性能的下降及骨折的發(fā)生，詳細(xì)機(jī)制需要進(jìn)一步研究。綜上所述，成熟期大鼠接受甲基強(qiáng)的松龍后，皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨骨量沒(méi)有顯著變化，DXA檢查難以發(fā)現(xiàn)甲基強(qiáng)的松龍注射成熟期雌性大鼠的骨丟失情況，其力學(xué)性能下降，提示糖皮質(zhì)激素更多的是引起骨質(zhì)量的改變而導(dǎo)致了力學(xué)性能的下降及骨折的發(fā)生。【參考文獻(xiàn)】［1］WuXP，LiaoEY，LUZY，etal．Evaluationofratbonemassmeasurementbydual-energyX-rayabsorptiometryanddeterminationofsensitiveregionsofbonelossinovariectomizedrat．ChinJEndocrinolMetab，2000，16(4):212-215．［2］DeNijsＲN．Glucocorticoid-inducedosteoporosis:areviewonpathophysiologyandtreatmentoptions．MinervaMed，2008，99(1):23-43．［3］TvanBrusselMS，BultinkIE，LemsWF．Preventionofglucocorticoid-inducedosteoporosis．ExpertOpinPharmacother，2018，10(6):997-1005．［4］WangY，Ohtsuka-IsoyaM，ShaoP，etal．Effectsofmethylprednisoloneonboneformationandresorptioninrats．JpnJPharmacol，2002，90(3):236-246．［5］LindgrenJU，MerchantCＲ，DeLucaHF．Effectof1，25-dihydroxyvitaminD3onosteopeniainducedbyprednisoloneinadultrats．CalcifyTissueInt．，1982，34(3):253-257．［6］WimalawansaSJ，SimmonsDJ．Preventionofcorticosteroidinducedbonelosswithalendronate．ProcSocExpBiolMed，1998，217(2):162-167．［7］HulleyPA，ConradieMM，LangeveldtCＲ，etal．Glucocorticoid-inducedosteoporosisintheratispreventedbythetyrosinephosphataseinhibitor，sodiumorthovanadate．Bone，2002，31(1):220-229．［8］FerrettiJL，GaffuriO，CapozzaＲ，etal．Dexamethasoneeffectsonmechanical，geometricanddensitometricpropertiesofratfemurdiaphysesasdescribedbyperipheralquantitativecomputerizedtomographyandbendingtests．Bone，1995，16(1):119-124．［9］McHughNA，VercesiHM，EganＲW，etal．Invivoratassay:boneremodelingandsteroideffectsonjuvenilebonebypQCTquantificationin7days．AmJPhysio