實(shí)驗(yàn)四血清γ球蛋白的提純xxl

第三次實(shí)驗(yàn)報(bào)告總結(jié)實(shí)驗(yàn)報(bào)告包括實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、原理、操作、結(jié)果、結(jié)論與討論五部分。原理寫得不完整。電泳及影響因素；血清中蛋白質(zhì)主要有5種，由于蛋白質(zhì)具有兩性解離，在pH=8.6緩沖溶液中，各蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，在電泳中向正極移動(dòng)；血清中各種蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量不同，在同一電泳過程中運(yùn)動(dòng)速度不同而分離；血清蛋白質(zhì)能與氨基黑10B特異性結(jié)合而顯現(xiàn)出藍(lán)色，并將各條帶剪下溶解于堿性溶液中，測(cè)定吸光度值則可以計(jì)算各蛋白相對(duì)含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)論與討論（不要自問自答，不要分1、2、3...，不要重復(fù)原理，不要寫思考題，不要寫注意事項(xiàng)）

給出結(jié)論（注意樣品是兔血清，與人血清比較的話，需要說明人和兔血清含量可能有所差異。）

結(jié)合結(jié)果分析（1.膜條上各條帶分離好不好？什么原因造成的？2.結(jié)果中各蛋白質(zhì)百分含量，說明哪些原因可能會(huì)造成各蛋白百分含量偏離正常值？）錯(cuò)別字太多。目前一頁\總數(shù)二十五頁\編于十點(diǎn)請(qǐng)同學(xué)們清洗自己小組以下用品每個(gè)小組：層析柱（1支）比色板（2塊）玻璃棒（1支）離心管（1支）滴管（2支）燒杯（2個(gè)）試管（13支）注意實(shí)驗(yàn)過程中每用一次清洗一次！目前二頁\總數(shù)二十五頁\編于十點(diǎn)問題1.血清蛋白質(zhì)的分類？

清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白2.分離純化蛋白質(zhì)的方法？

電泳、透析及超濾、有機(jī)溶劑沉淀、鹽析、免疫沉淀、層析、超速離心法等3.鹽析？層析？透析？

加入中性鹽破壞蛋白質(zhì)穩(wěn)定因素而使其沉淀（水化膜和電荷層）利用各組分理化性質(zhì)不同而分離（本實(shí)驗(yàn)是利用組分分子大小不同而分離）半透膜把大小分子分開4.本實(shí)驗(yàn)鹽析所用硫酸銨飽和度是多少？

33%5.定性檢測(cè)蛋白質(zhì)和銨根離子的方法？

縮二脲反應(yīng)（紫紅色）或者與磺柳酸反應(yīng)生成白色沉淀納氏試劑（黃色或棕色）目前三頁\總數(shù)二十五頁\編于十點(diǎn)一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.掌握蛋白質(zhì)分離純化方法；2.掌握鹽析、凝膠層析、透析法分離純化蛋白質(zhì)的基本原理；3.熟悉離心機(jī)的操作；4.熟悉蛋白質(zhì)、NH4+定性檢測(cè)的方法。目前四頁\總數(shù)二十五頁\編于十點(diǎn)分離純化蛋白質(zhì)的方法沉淀法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法層析法電學(xué)法電泳法等電聚焦離子交換層析吸附層析凝膠過濾（分子篩）親和層析離心膜分離技術(shù)透析超濾目前五頁\總數(shù)二十五頁\編于十點(diǎn)二.實(shí)驗(yàn)原理

本實(shí)驗(yàn)是應(yīng)用相同濃度的硫酸銨反復(fù)鹽析分離血清中的γ-球蛋白，再利用凝膠層析法除鹽，即可得到比較純的γ-球蛋白。

采用鹽析法分離清蛋白（主要是清蛋白），再用透析方法除去小分子物質(zhì)。目前六頁\總數(shù)二十五頁\編于十點(diǎn)二.實(shí)驗(yàn)原理（一）鹽析（salting-out）定義：加入大量中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素并使其從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。原理:破壞蛋白質(zhì)兩個(gè)穩(wěn)定因素：水化膜和電荷層中性鹽：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。優(yōu)點(diǎn)：蛋白質(zhì)不變性，常用方法。目前七頁\總數(shù)二十五頁\編于十點(diǎn)二.實(shí)驗(yàn)原理（二）透析（dialysis）定義：利用半透膜把大小分子分開。透析法是利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過半透膜，而大分子物質(zhì)不能通過半透膜的性質(zhì)，達(dá)到分離的方法。其利用半透膜原理，通過擴(kuò)散、對(duì)流體內(nèi)各種有害以及多余的代謝廢物和過多的電解質(zhì)移出體外，達(dá)到凈化血液的目的，并且達(dá)到糾正水電解質(zhì)及酸堿平衡的目的。臨床應(yīng)用：血液透析

目前八頁\總數(shù)二十五頁\編于十點(diǎn)二.實(shí)驗(yàn)原理（三）層析（chromatography）

層析技術(shù)是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)（如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等）的差別，使各組分在支持物上集中分布在不同區(qū)域，借此將各組分分離。

按層析的原理不同可以分為：吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠層析和親和層析。（教程P25）

凝膠是一類具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)（分子大小不同）

小分子進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，流程長，下移速度慢；大分子不能進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中去，只能分布在顆粒的間隙中，所以流程短，向下移動(dòng)速度快。目前九頁\總數(shù)二十五頁\編于十點(diǎn)二.實(shí)驗(yàn)原理凝膠層析法（根據(jù)分子大小差異而分離）目前十頁\總數(shù)二十五頁\編于十點(diǎn)二.實(shí)驗(yàn)原理（四）離心（centrifuge）

離心技術(shù)是利用離心力，依據(jù)物質(zhì)的沉降系數(shù)、擴(kuò)散系數(shù)和浮力密度差異而進(jìn)行物質(zhì)的分離、濃縮和分析的一種技術(shù)。目前十一頁\總數(shù)二十五頁\編于十點(diǎn)二.實(shí)驗(yàn)原理離心操作要領(lǐng)1、根據(jù)待離心的溶液性質(zhì)及體積選擇合適的離心管。裝載液體時(shí)要按各種離心機(jī)操作說明進(jìn)行。無蓋離心管不能裝的太滿。密封的或有蓋離心管常要求裝滿，以免離心管變形。2、檢查離心管套筒是否完好、套筒內(nèi)有沒有軟膠墊或棉花。3、精確地平衡離心管及其內(nèi)容物（配平）。4、平衡后的離心管和內(nèi)容物（包括套筒）應(yīng)對(duì)稱放置。5、啟動(dòng)離心時(shí)離心速度由慢到快。目前十二頁\總數(shù)二十五頁\編于十點(diǎn)二.實(shí)驗(yàn)原理（五）檢測(cè)蛋白質(zhì)、NH4+的方法①檢測(cè)蛋白質(zhì)縮二脲試劑：溶液顯紫紅色20％磺柳酸：有白色沉淀產(chǎn)生②檢測(cè)NH4+

納氏試劑：黃色或棕色目前十三頁\總數(shù)二十五頁\編于十點(diǎn)三.實(shí)驗(yàn)操作1、鹽析2、透析3、層析（脫鹽）4、檢測(cè)目前十四頁\總數(shù)二十五頁\編于十點(diǎn)1、鹽析取離心管一支加入血清2ml加入2mlPBS，搖勻逐滴加入pH7.2飽和(NH4)2SO4

2ml,搖勻上清液（主要含清蛋白）傾入試管中靜置10分鐘，再離心（2000轉(zhuǎn)/分）10分鐘沉淀用1mlPBS攪拌溶解逐滴加飽和(NH4)2SO4

0.5ml,搖勻傾棄上清液（主要含α、β球蛋白）沉淀即為初步純化的γ－球蛋白透析脫鹽靜置10分鐘，再離心（2000轉(zhuǎn)/分）10分鐘用于配平用于配平樣品為豬血清目前十五頁\總數(shù)二十五頁\編于十點(diǎn)2、透析清蛋白

換水①透析袋剛放入水中時(shí),立即取袋外液體檢查有無NH4＋；②每隔4分鐘檢查一次，共3次，比較NH4＋透出的情況。①約0.5小時(shí)，檢查袋外液體的NH4＋情況；②取袋外液2滴，置于小試管中，然后滴加20％磺柳酸1~2滴，觀察有無沉淀產(chǎn)生。水

水

目前十六頁\總數(shù)二十五頁\編于十點(diǎn)3、層析

12345678910②上樣γ－球蛋白，PBS10滴溶解

①裝柱

裝柱前用濾紙片堵住層析柱下口，防止下端玻紗堵塞葡聚糖凝膠G－25，柱高3/4~2/3柱長流速：每分鐘10滴左右

③加入洗脫劑PBS10ml④收集20滴換一支試管目前十七頁\總數(shù)二十五頁\編于十點(diǎn)⑤

層析后洗脫液檢測(cè)每組兩塊比色板,洗凈備用。一塊在各孔滴加納氏試劑（檢測(cè)NH4+）,另一塊滴加縮二脲試劑（檢測(cè)蛋白質(zhì)）。若發(fā)現(xiàn)有顯色反應(yīng)此孔顯色劑棄用。檢測(cè)蛋白及銨根離子不用滴管,避免污染,直接用試管傾倒。用“-”表示無現(xiàn)象，用“+”,“++”,“+++”等表示顏色深淺。⑥

回收凝膠目前十八頁\總數(shù)二十五頁\編于十點(diǎn)四.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(用+-號(hào)表示，不寫顏色)表1.層析后洗脫液的顯色結(jié)果表2.透析后的袋外溶液顯色結(jié)果試管編號(hào)12345678910縮二脲試劑檢測(cè)后現(xiàn)象納氏試劑檢測(cè)后現(xiàn)象檢測(cè)次數(shù)123456試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑20%磺柳酸現(xiàn)象檢測(cè)人：時(shí)間：檢測(cè)人：時(shí)間：目前十九頁\總數(shù)二十五頁\編于十點(diǎn)五.注意事項(xiàng)１.正確使用離心機(jī)。２.裝柱時(shí)檢查層析柱下端是否有濾紙片，是否漏水。３.裝柱后凝膠均一、無斷層，無氣泡，柱床面平整。４.柱床面保持有緩沖液。５.層析加樣時(shí)動(dòng)作緩慢輕柔，不要破壞柱床面的平整。６.每用一次滴管，請(qǐng)用水清洗干凈，防止試劑及被測(cè)樣品交叉污染。7.兩人一組，分工協(xié)作。目前二十頁\總數(shù)二十五頁\編于十點(diǎn)思考1.為什么硫酸銨能夠使蛋白質(zhì)沉淀？2.本實(shí)驗(yàn)鹽析所用鹽的飽和度是多少？為什么能夠沉淀γ-球蛋白？3.如何證明分離純化的樣品是何種蛋白質(zhì)？4.兩步鹽析之后，沉淀中含有哪些物質(zhì)？5.層析結(jié)果好壞的判斷標(biāo)準(zhǔn)是什么？6.透析時(shí)，燒杯中出現(xiàn)蛋白質(zhì)說明什么問題？目前二十一頁\總數(shù)二十五頁\編于十點(diǎn)預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)五細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定1.核酸的基本組成2.DNA和RNA結(jié)構(gòu)及分布區(qū)域3.核酸理化性質(zhì)4.實(shí)驗(yàn)原理及操作5.實(shí)驗(yàn)中采用了幾種離心方法目前二十二頁\總數(shù)二十五頁\編于十點(diǎn)教學(xué)大綱一教學(xué)目的

學(xué)習(xí)綜合利用鹽析、凝膠層析、透析等多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化的方法。二教學(xué)要求

（一）掌握鹽析、凝膠層析、透析法分離純化蛋白質(zhì)的基本原理。