第八章熒光分光光法演示文稿

第八章熒光分光光度法演示文稿目前一頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點優(yōu)選第八章熒光分光光度法目前二頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點§8-1概述一、分子發(fā)光分析法及其分類某些物質(zhì)的分子吸收一定能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，以光輻射的形式從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，這種現(xiàn)象稱為分子發(fā)光，在此基礎上建立起來的分析方法為分子發(fā)光分析法較高激發(fā)態(tài)基態(tài)吸收能量受激光輻射退激分子在退激過程中以光輻射形式釋放能量目前三頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點根據(jù)分子受激時所吸收能源及輻射光的機理不同分為以下幾類：光致發(fā)光：以光源來激發(fā)而發(fā)光

電致發(fā)光：以電能來激發(fā)而發(fā)光—原子發(fā)射光譜法生物發(fā)光：以生物體釋放的能量激發(fā)而發(fā)光化學發(fā)光：以化學反應能激發(fā)而發(fā)光--化學發(fā)光分析法熒光—熒光分析法磷光—磷光分析法目前四頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點二、分子熒光分析法的特點1.靈敏度高熒光強度隨激發(fā)光強度增強而增強（提高激發(fā)光強度，可提高熒光強度

采用高靈敏度的檢測系統(tǒng)可大大提高靈敏度，檢測限熒光分析法比分光光度法低2~4個數(shù)量級激發(fā)發(fā)射熒光強強激發(fā)光物質(zhì)目前五頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點2.選擇性好不同的物質(zhì)用不同的光進行激發(fā)，選擇不同的激發(fā)光波長不同的物質(zhì)發(fā)射的熒光不同，選擇不同的檢測熒光波長比較容易排除其它物質(zhì)的干擾，選擇性好3.實驗方法簡單4.待測樣品用量少；儀器價格適中；測定范圍較廣具發(fā)光強度可定量測定許多痕量的無機物和有機物，廣泛應用在生物化學、分子生物學、免疫學及農(nóng)牧產(chǎn)品分析、衛(wèi)生檢疫等領域。熒光法比磷光法應用廣泛。目前六頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點§8-2熒光和磷光光譜法一、熒光和磷光光譜的產(chǎn)生具有不飽和基團的基態(tài)分子光照后，價電子躍遷產(chǎn)生熒光和磷光基態(tài)分子價電子躍遷到激發(fā)態(tài)光照激發(fā)去激發(fā)光*

*n基態(tài)目前七頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點1.電子自旋狀態(tài)的多重性大多數(shù)分子含有偶數(shù)電子，基態(tài)分子每一個軌道中兩個電子自旋方向總是相反的，處于基態(tài)單重態(tài)。用“S0”

表示；當物質(zhì)受光照射時，基態(tài)分子吸收光能產(chǎn)生電子能級躍遷，由基態(tài)躍遷至更高的單重態(tài)，電子自旋方向沒有改變，凈自旋=0.這種躍遷是符合光譜定律的?；鶓B(tài)單重態(tài)S0第一激發(fā)單重態(tài)S1S0,S1,S2,S3分別代表基態(tài),第一,二,三激發(fā)單重態(tài)單重態(tài)分子具有抗磁性，激發(fā)態(tài)的平均壽命約為10-8目前八頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點若分子中電子躍遷過程中伴隨著自旋方向的改變，由基態(tài)單重態(tài)→激發(fā)三重態(tài)，凈自旋0。這種躍遷為禁阻躍遷

T1、T2、T3分別表示第一、二、三激發(fā)三重態(tài)基態(tài)單重態(tài)S0第一激發(fā)三重態(tài)T1自旋平行三重態(tài)分子具有順磁性，激發(fā)態(tài)的平均壽命約為10-4~1S目前九頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點分子中電子受激躍遷到激發(fā)態(tài)后，處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，去激返回到較低激發(fā)態(tài)或基態(tài)時有兩種方式：無輻射去激和輻射去激2.無輻射去激——不伴隨發(fā)光現(xiàn)象的過程叫無輻射去激，體系內(nèi)的多余的能量以熱的形式釋放。包括：內(nèi)部轉(zhuǎn)換（IC）—相同的多重態(tài)之間的轉(zhuǎn)換S-S系間竄躍（ISC）—不同的多重態(tài)之間的轉(zhuǎn)換S-T振動馳豫（VR）—同一電子能級中，從較高振動能級到較低振動能級的過程外部轉(zhuǎn)移—指激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子的相互作用及能量轉(zhuǎn)移，使熒光或磷光強度減弱或消滅發(fā)生系間竄躍電子需轉(zhuǎn)向，S1—T1間進行，比內(nèi)部轉(zhuǎn)換困難目前十頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點T1S0ISCVRVRIC吸光吸光S0S1S2VR：振動馳豫IC：內(nèi)部轉(zhuǎn)換ISC：系間竄躍目前十一頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點3.熒光和磷光光譜的產(chǎn)生—輻射去激處于S1或T1態(tài)的電子返回S0態(tài)時，伴隨有發(fā)光現(xiàn)象，這種過程叫輻射去激

S1或T1S0

發(fā)光（1）熒光：當電子從第一激發(fā)單重態(tài)S1的最低振動能級回到基態(tài)S0各振動能級所產(chǎn)生的光輻射叫熒光熒光是相同多重態(tài)間的允許躍遷，產(chǎn)生速度快，10-9~10-6s，又叫快速熒光或瞬時熒光，外部光源停止照射，熒光馬上熄滅無論開始電子被激發(fā)至什么高能級，它都經(jīng)過無輻射去激消耗能量后到S1的最低振動能級，發(fā)射熒光，熒光波長比激發(fā)光波長長。熒>激目前十二頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點T1S0ISCVRVRIC吸光吸光熒光圖5-1分子熒光光譜產(chǎn)生過程示意圖S0S1S2VR：振動馳豫IC：內(nèi)部轉(zhuǎn)換ISC：系間竄躍目前十三頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點（2）磷光當受激電子降到S1的最低振動能級后，未發(fā)射熒光，而是經(jīng)過系間竄躍到T1振動能級，經(jīng)振動馳豫到T1最低振動能級，從T1最低振動能級回到基態(tài)的各個振動能級所發(fā)射的光叫磷光從T1

S1要改變電子自旋，發(fā)光速度慢，約為10-4~10s，光照停止后，磷光仍可持續(xù)一段時間分子相互碰撞的無輻射能量塤耗大，所以磷光的波長更長磷>熒>激

*易產(chǎn)生熒光

n*易產(chǎn)生磷光目前十四頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點T1S0ISCVRVRIC吸光吸光熒光

磷光圖5-1分子熒光、磷光光譜產(chǎn)生過程示意圖S0S1S2VR：振動馳豫IC：內(nèi)部轉(zhuǎn)換ISC：系間竄躍VR目前十五頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點二、熒光、磷光與分子結(jié)構的關系了解熒光與分子結(jié)構的關系，可以預測哪些物質(zhì)能產(chǎn)生熒光，在什么條件下產(chǎn)生，以及發(fā)射的熒光有什么特征以便更好地運用熒光分析技術，采取一些措施把不發(fā)熒光的物質(zhì)產(chǎn)生熒光，即把非熒光體變成熒光體，弱熒光體變成強熒光體（一）熒光效率熒光強度常用熒光量子效率φf來描述

熒光量子效率f=發(fā)熒光的分子數(shù)激發(fā)態(tài)分子總數(shù)f

是一個物質(zhì)熒光特性的重要參數(shù)，反映了熒光物質(zhì)發(fā)射熒光的能力，f

越大，熒光越強，在0~1之間目前十六頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點若以各種躍遷速率常數(shù)來表示Kf為熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)——取決于物質(zhì)的化學結(jié)構∑Ki為非輻射躍遷的速率常數(shù)之和——主要取決于化學環(huán)境，也與化學結(jié)構有關分析上有應用價值的熒光化合物的熒光效率在0.1~1之間目前十七頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點至今對激發(fā)態(tài)分子的性質(zhì)了解不深，無法定量地描述熒光與分子結(jié)構之間的關系一般情況，有機芳香族化合物及金屬離子配合物是最強最有用的熒光體（二）熒光磷光與有機化合物結(jié)構的關系物質(zhì)只有吸收了紫外可見光，產(chǎn)生*n*躍遷，產(chǎn)生熒光*與n*躍遷相比，摩爾吸收系數(shù)大102~103，壽命短*躍遷常產(chǎn)生較強的熒光，n*躍遷產(chǎn)生的熒光弱，但可產(chǎn)生系間竄躍，產(chǎn)生更強的磷光目前十八頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點1.共軛體系——有較強的熒光具有共軛體系的芳環(huán)或雜環(huán)化合物，電子共軛程度越大，越易產(chǎn)生熒光;環(huán)越多，共軛程度越大，產(chǎn)生熒光波長越長，發(fā)射的熒光強度越強fex/nm

em/nm0.112052780.292863100.46365400苯萘蒽350菲線狀環(huán)結(jié)構比非線狀結(jié)構的熒光波長長目前十九頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點

芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)生熒光多環(huán)芳烴是重要的環(huán)境污染物，可用熒光法測定

3，4-苯并芘是強致癌物ex=386nm

em=430nm目前二十頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點2.剛性平面結(jié)構—較穩(wěn)定的平面結(jié)構具有強熒光的分子多數(shù)有剛性平面結(jié)構熒光素：氧橋把兩個環(huán)固定在一個平面上，具有平面結(jié)構，強熒光物質(zhì)酚酞：無氧橋把兩個環(huán)固定，不能很好的共平面，為非熒光物質(zhì)目前二十一頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點例1，2-二苯乙烯反式：平面構型強熒光體順式：非平面構型非熒光體目前二十二頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點（三）金屬螯合物的熒光大多數(shù)無機鹽類金屬離子，不能產(chǎn)生熒光，但某些螯合物都能產(chǎn)生很強的熒光，可用于痕量金屬離子的測定不少有機配體是弱熒光體或不發(fā)熒光，但與Mn+形成螯合物后變?yōu)槠矫鏄嬓停蜁篃晒饧訌娀虍a(chǎn)生熒光例：8-羥基喹啉為弱熒光體，與Mn+—Al3+、Mg2+形成螯合物后，能形成剛性結(jié)構，熒光加強目前二十三頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點（四）取代基的類型——取代基對熒光物質(zhì)的熒光特征和強度也有很大影響。分成三類：（1）增強熒光的取代基

——

有-OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等給電子基團由于基團的n電子（孤對電子）的電子云與苯環(huán)上的軌道平行，共享了共軛電子，擴大了共軛體系，使熒光波長長移，熒光強度增強目前二十四頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點（2）減弱熒光的取代基——-COOH、-NO2

、-COOR、-NO、-SH吸電子基團,使熒光波長短移，熒光強度減弱芳環(huán)上被F、Cl、Br、I取代后，使系間竄躍加強，磷光增強，熒光減弱。其熒光強度隨鹵素原子量增加而減弱，磷光相應增強，這種效應為重原子效應。（3）影響不明顯的取代基

——-NH3+、-R、-SO3H等目前二十五頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點三、環(huán)境對熒光的影響1.溶劑的影響同一熒光物質(zhì)在不同的溶劑中可能表現(xiàn)出不同的熒光性質(zhì)一般來說，溶劑的極性增強，熒光波長長移，熒光強度增大

2.溫度的影響——低溫下測定，提高靈敏度因為輻射躍遷的速率基本不隨溫度變，而非輻射躍遷隨溫度升高顯著增大。大多數(shù)熒光物質(zhì)都隨溶液溫度升高熒光效率下降，熒光強度減弱。溫度對磷光影響更大目前二十六頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點3.pH的影響大多數(shù)含有酸性或堿性基團的芳香族化合物的熒光性質(zhì)受溶液pH的影響很大共軛酸堿對是具有不同熒光性質(zhì)的兩種型體，具有各自的熒光效率和熒光波長例：苯酚離子化后，熒光消失pH≈1有熒光pH≈13無熒光目前二十七頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點但兩個苯環(huán)相連的化合物，又表現(xiàn)出相反的性質(zhì)，分子形式無熒光，離子化后顯熒光例：—苯酚有熒光無熒光另外，表面活性劑也會影響熒光強度和特性目前二十八頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點四、熒光強度與熒光物質(zhì)濃度的關系用強度為I0的入射光，照射到液池內(nèi)的熒光物質(zhì)時，產(chǎn)生熒光，熒光強度If

用儀器測得，在熒光濃度很稀(A<0.05)時，熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光強度If與濃度有下面的關系If=fIa=f（I0-I）Ia為吸收的輻射強度I0為入射光強度熒光池I0IIf熒光強度檢測器If=f（I0-I010-A

）

=fI0

（1-10-A

）I=I010-A將上式展開目前二十九頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點當A﹤0.05時，方括號中其它各項與第一項相比可忽略不計，上式簡化

If=2.3fI0A=2.3fI0bc當A﹤0.05時，

If與f、I0、和c有關，對一給定物質(zhì)，當激發(fā)光波長和強度一定時，f、I0、和b為常數(shù)，合并為K

If=KCIp=KC定量分析依據(jù)目前三十頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點熒光強度與物質(zhì)濃度呈線形關系，If=KC只有在濃度低時使用，熒光物質(zhì)測定的是微量或痕量組分，靈敏度高濃度高時，If與C不呈線形關系，有時C增大，If反而降低因為公式[]中后面影響，有時發(fā)生熒光猝滅效應目前三十一頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點熒光猝滅

——熒光物質(zhì)與溶劑或其它物質(zhì)之間發(fā)生化學反應，或發(fā)生碰撞后使熒光強度下降或熒光效率f下降稱為熒光猝滅。使熒光強度降低的物質(zhì)稱為熒光猝滅劑氧分子及產(chǎn)生重原子效應的溴化物、碘化物等都是常見的熒光猝滅劑碰撞猝滅——M+激→M*M*+Q→M+Q+熱自熄滅——熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光被熒光物質(zhì)的基態(tài)分子所吸收，即自吸收現(xiàn)象目前三十二頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點

熒光分析儀器——主要由光源、單色器、液槽、檢測器和顯示器組成光源第一單色器液池檢測器第二單色器檢測器放大器及記錄器exem與分光光度計有兩點不同①兩個單色器②檢測器與激發(fā)光互成直角I0I五、熒光分析儀器目前三十三頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點1、光源激發(fā)光源一般要求比吸收測量中的光源有更大的發(fā)射強度；適用波長范圍寬熒光計中，常使用鹵鎢燈作光源熒光光度計中常用高壓汞燈和氙弧燈利用汞蒸氣放電發(fā)光的光源；常用其發(fā)射365nm、405nm、436nm三條譜線以365nm的譜線最強應用最廣泛的一種光源，可發(fā)射250~800nm很強的連續(xù)光源目前三十四頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點2、單色器熒光計用濾光片作單色器，熒光計只能用于定量分析，不能獲得光譜大多數(shù)熒光光度計一般采用兩個光柵單色器，有較高的分辨率，能掃描圖譜，既可獲得激發(fā)光譜，又可獲得熒光光譜第一單色器作用：分離出所需要的激發(fā)光，選擇最佳激發(fā)波長ex

，用此激發(fā)光激發(fā)液池內(nèi)的熒光物質(zhì)

ex第二單色器作用：濾掉一些雜散光和雜質(zhì)所發(fā)射的干擾光，用來選擇測定用的熒光波長em。在選定的

em

下測定熒光強度，定量分析目前三十五頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點3、樣品池盛放測定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上邊4、檢測器把光信號轉(zhuǎn)化成電信號,放大,直接轉(zhuǎn)成熒光強度熒光的強度一般較弱，要求檢測器有較高的靈敏度，熒光光度計采用光電倍增管熒光分析比吸收光度法具有高得多的靈敏度，是因為熒光強度與激發(fā)光強度成正比，提高激發(fā)光強度可大大提高熒光強度5、讀出裝置記錄儀記錄或打印機打印出結(jié)果，掃描激發(fā)光譜和發(fā)射光譜目前三十六頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點（二）激發(fā)光譜和熒光、磷光光譜熒光和磷光均為光致發(fā)光，合適的激發(fā)光波長需根據(jù)激發(fā)光譜確定——激發(fā)光譜是在固定熒光波長下，測量熒光體的熒光強度隨激發(fā)波長變化的光譜Iex固定em熒光波長獲得方法：先把第二單色器的波長固定，使測定的em不變，改變第一單色器波長，從200~700nm掃描，讓不同波長的光照在熒光物質(zhì)上，測定它的熒光強度，以I為縱坐標，ex為橫坐標得左圖，即熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜從曲線上找出ex，實際上選波長較長的高波長峰目前三十七頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點Iem固定ex激發(fā)光波長獲得方法：先把第一單色器的波長固定，使激發(fā)的ex不變，改變第二單色器波長，讓不同波長的光掃描，測定它的發(fā)光強度，以I為縱坐標，em為橫坐標得左圖，即熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜從曲線上找出最大的em目前三十八頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點從圖中看出磷＞熒＞

激圖吸收峰熒光峰磷光峰目前三十九頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點六、

熒光分析及應用（一）定量分析方法定量分析依據(jù)If=KCIp=KC1.標準曲線法——最常用的定量分析方法將已知量的標準物質(zhì)與試樣在相同條件下處理，配制一系列標準液，測定它們的相對發(fā)光強度。以相對熒光強度為縱坐標，以標準溶液的濃度為橫坐標濃度C1C2C3C4C5Cx熒光強度If1If2If3If4If5IfxIfIfxCxC目前四十頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點2.熒光猝滅法把熒光猝滅用在定量分析上，具有較高的靈敏度和選擇性若熒光物質(zhì)M與猝滅劑Q生成不發(fā)熒光的基態(tài)配合物MQM+Q=MQ（非熒光物質(zhì)）經(jīng)推導得出：猝滅劑加入前的熒光強度猝滅劑加入后試液的熒光強度常數(shù)猝滅劑濃度I前/I后與C（Q）有線性關系，可求猝滅劑含量目前四十一頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點與標準曲線法相似，對一定濃度的熒光體系，分別加入一系列不同量的猝滅劑Q，配成一個熒光物質(zhì)—猝滅劑體系，然后在相同條件下測定它們的熒光強度，得一曲線取相同熒光物質(zhì)CMCMCMCM

…

CM

加不同量QCQ0CQ1CQ2CQ3…

CQx(CQ0=0)

測IfI前

I后1I后2I后3

…

I后

x

計算I前/I后I前/I后1

I前/I后2I前/I后3

…

I前/I后x

I前/I后xCQxCQI前/I后目前四十二頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點3.比較法——比較簡單如果試樣數(shù)量不多，可用比較法進行測量配一標準溶液濃度為Cs，Cs與未知液濃度Cx相近，并在相同條件下測定它們的熒光強度未知液If

x=KCx

標準液If

s=KCs

比較目前四十三頁\總數(shù)四十八頁\編于十八點4.多組分混合物的熒光分析(1)如果兩組分的熒光峰相互不干擾,可直接測定可分別在各自的熒波長處測定,求出它們的含量(2)如果兩組分的熒光峰相互干擾,但激發(fā)光譜有顯著區(qū)別,在某一激發(fā)光下一個組分產(chǎn)生熒光峰,另一組分不產(chǎn)生熒