G試驗侵襲性真菌病的輔助診斷方法

內(nèi)容目錄一、真菌感染概一、真菌感染概述二、真菌與葡聚糖三、鱟試驗與G試驗四、G試驗——臨床意義五、“生物探針”介紹六、“生物探針”操作流程七、“生物探針”的臨床比對八、G試驗的影響因素目前一頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點湛江安度斯生物有限公司是查爾斯河公司設在中國的子公司，是中國細菌內(nèi)毒素檢測試劑的最大供應商，也是中國細菌內(nèi)毒素檢測領域的技術領導者和創(chuàng)新先鋒；世界著名的美洲鱟試劑（LAL）生產(chǎn)企業(yè)——美國CR恩度斯弗公司（CharlesRiverEndosafe,Inc.），也是查爾斯河實驗室公司的子公司湛江安度斯的簡介目前二頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點CharlesRiverLaboratories作為全球最大的實驗動物公司，CharlesRiverLaboratories一直是全球實驗動物商業(yè)化繁育和市場供應的領導者，擁有分布在北美、歐洲和日本的15個分設施和遍布全球的銷售網(wǎng)絡；已成為一個生物醫(yī)學前臨床產(chǎn)品和服務的主要供應商。目前三頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點庫珀博士CREndosafe（恩度斯弗）公司是美國著名三大鱟試劑企業(yè)之一,有國際知名權威學者詹母斯弗.庫珀博士(Dr.JammesF.Cooper)創(chuàng)建。庫珀博士是細菌內(nèi)毒素檢查研究領域的先驅。1971年他與Lein及Banger等人提出以鱟實驗法檢查熱源，并率先證明了鱟實驗法作為注射藥品熱源檢查的敏感方法的價值。1972年他協(xié)助美國(TheparentralDrugAssociation)的鱟試劑.他一直主持著美國非經(jīng)腸道藥物協(xié)會(TheparenteralDrugAssociatoin)的鱟實驗應用促進工作,以及每年一屆的美國南卡羅納州查爾頓的鱟實驗學術會議。目前四頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點庫珀博士創(chuàng)建的Endosafe公司現(xiàn)以成為美國鱟試劑(LAL)市場最大的供應商.該公司的鱟試劑以其良好的穩(wěn)定性,廣泛的適用性以及優(yōu)越的抗干擾性能享譽國際醫(yī)藥工業(yè)界.目前五頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點一、真菌感染概述真菌感染：真菌感染在通常情況下我們最常見的是表皮的感染，例如頭癬、體癬、甲癬等，由于侵犯的部位大都表淺，不會導致嚴重問題，因而叫淺部真菌感染；深部真菌感染則是真菌突破人體天然屏障導致組織臟器的感染。6目前六頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點美國死于感染性疾病的十大原因820圍產(chǎn)期828真菌101053胃腸道1305圍產(chǎn)期91259結核1277肝膽管82370真菌1377胃腸道74596肝膽管1402細菌性腦膜炎65577心臟2333肺結核513,413腎臟/泌尿道2486心臟416,524HIV/AIDS8006腎臟/泌尿道322,396敗血癥9438敗血癥287,181呼吸道56,966呼吸道1死亡人數(shù)感染類型死亡人數(shù)感染類型19971980真菌感染的死亡率上升了3.4倍（死亡率：0.7~2.4/100,000）7目前七頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點EORTC/MSG原稱侵襲性真菌感染（IFI），修訂后改稱IFD；是指真菌侵入人體，在組織、器官或血液中生長、繁殖，并導致炎癥反應及組織損傷的疾病。是真菌感染致死的重要原因侵襲性真菌病(InvasiveFungalDisease,IFD)8目前八頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點侵襲性真菌病已變得越來越常見9目前九頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點侵襲性真菌感染的診斷標準G試驗可作為擬診病例的微生物學標志10目前十頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點主要可引發(fā)侵襲性真菌病的疾病腫瘤類：胃癌，肝癌，肝內(nèi)膽管癌，肺癌，多發(fā)性骨髓瘤，白血病，惡性淋巴瘤11目前十一頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點二、真菌與葡聚糖2023/5/17121.某些真菌的細胞壁結構目前十二頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點2.細胞壁含有葡聚糖組分的真菌：

（1）是導致侵襲性真菌病(IFD)的常見真菌。

（2）細胞壁有葡聚糖組分2023/5/1713目前十三頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點這類真菌有：

念珠菌

曲霉菌

耶氏肺孢菌

鐮刀酶

隱球菌接合菌.......2023/5/1714目前十四頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點北京301醫(yī)院尸檢結果（77～97年）肺真菌病發(fā)生率3.7％(38/1027)隱球菌病、接合菌病占真菌病比例不高15目前十五頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點當人體深部受這類真菌感染時，真菌在代謝過程會不斷釋放出葡聚糖。檢查患者的血液（血漿或血清），會發(fā)現(xiàn)葡聚糖含量明顯高于非感染者。因此，葡聚糖可作為具有這種細胞結構的真菌感染標識物。2023/5/1716目前十六頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點三、鱟試驗與G試驗1.鱟（Hòu，后）試驗2023/5/1717目前十七頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點

鱟是地球上最古老的海洋生物之一，已有三億多年的歷史，人們稱它為“活化石”。雌雄2023/5/1718目前十八頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點研究發(fā)現(xiàn)，鱟的循環(huán)細胞（阿米巴細胞）中含有一種特殊的凝固酶原。這種凝固酶原可以被自然界廣泛存在的兩種物質激活為凝固酶，從而導致一系列的生化反應。這兩種物質就是脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和(1-3)--D葡聚糖。2023/5/1719目前十九頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點

人們利用鱟的阿米巴細胞溶胞物制備成了鱟試劑（LAL或TAL）。通常稱使用鱟試劑檢測脂多糖（LPS）或-葡聚糖（-G）的試驗為鱟試驗（LALTestorTAL

Test）。2023/5/1720目前二十頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點2.鱟試驗反應機理21目前二十一頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點3.鱟試驗的應用應用I：細菌內(nèi)毒素檢查(BacterialEndotoxinTest,BET)2023/5/1722目前二十二頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點研究發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陰性細菌的細胞壁都含有一種叫內(nèi)毒素(Endotoxin)的組分。2023/5/1723目前二十三頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點

內(nèi)毒素是能夠引起哺乳動物原反應的主要熱原物質。革蘭氏陰性細菌在新陳代謝過程不斷地向環(huán)境釋放內(nèi)毒素，污染藥品和醫(yī)療器械。因此注射藥品和醫(yī)療器械都要求必須作細菌內(nèi)毒素檢查（BET）。2023/5/1724目前二十四頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點應用II：

革蘭氏陰性菌脂多糖檢測2023/5/1725目前二十五頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點細菌內(nèi)毒素的化學成分是脂多糖。當人體深部感染革蘭氏陰性菌時，細菌會在體內(nèi)不斷釋放內(nèi)毒素（脂多糖）。檢查患者的血液（血漿）、腹水、尿液及腦脊液，會發(fā)現(xiàn)脂多糖明顯高于非感染者。脂多糖檢測對敗血癥、嚴重器官衰竭的快速輔助診斷有臨床價值。2023/5/1726目前二十六頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點應用III：

真菌(1-3)--D葡聚糖檢測2023/5/1727目前二十七頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點

醫(yī)學上通常把用于檢測真菌葡聚糖的鱟試驗稱為G試驗。這是取葡聚糖的英文名稱Glucan的首字母來命名該試驗。2023/5/1728目前二十八頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點需要指出的是，隱球菌的細胞壁雖然有葡聚糖組分，在隱球菌感染患者的血液中卻檢測不出葡聚糖異常。這可能與隱球菌具有特殊的細胞被膜有關。因此G試驗不適合對隱球菌感染的檢測。2023/5/1729目前二十九頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點四、G試驗——臨床意義30目前三十頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點G試驗的臨床意義31目前三十一頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點G試驗的臨床意義32目前三十二頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點33目前三十三頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點34目前三十四頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點G試驗應用科室35目前三十五頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點五、“生物探針”介紹36目前三十六頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點“生物探針”介紹37目前三十七頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點“生物探針”介紹38目前三十八頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點“生物探針”介紹39目前三十九頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點“生物探針”介紹40目前四十頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點“生物探針”功能快速定量的臨床檢測方法，幫助臨床醫(yī)生早期診斷目前常規(guī)方法難以判斷的侵襲性真菌感染、革蘭氏陰性菌感染，便于對感染的早期診斷、早期治療及對治療的療效判定?？蓹z測標本：血漿、血清、尿液、腹水、腦脊液等41目前四十一頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點六、“生物探針”操作流程42目前四十二頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點“生物探針”操作流程43目前四十三頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點“生物探針”操作流程44目前四十四頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點“生物探針”操作流程45目前四十五頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點“生物探針”操作流程46目前四十六頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點“生物探針”操作流程47目前四十七頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點“生物探針”操作流程48目前四十八頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點“生物探針”操作流程49目前四十九頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點“生物探針”操作流程數(shù)據(jù)可接入LIS系統(tǒng)等50目前五十頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點侵襲性真菌感染的臨床檢測方法對比51目前五十一頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點產(chǎn)品特點靈敏度高快速檢測方法嚴謹準確性高特異性好臨床符合率高52目前五十二頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點七、“生物探針”的臨床比對J廠家的-G試劑、LPS試劑均無特異性53目前五十三頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點最低檢測限最低濃度重復性廠商 安度斯 最低檢測限 10pg/ml編號 檢測結果(pg/ml) 陰性(pg/ml)

檢測日期1 10.3

<1.3

3.62 10.1

3 11.0 4 9.8 5 9.8 6 10.8 7 10.1 8 10.0 9 9.6 10 10.3

CV=6.85%11 10.0 12 9.8 13 10.7 14 9.8 15 12.4 16 10.3 17 9.7 18 9.6 19 9.4 20 9.9 21 9.6 目前五十四頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點批內(nèi)精密度目前五十五頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點批間精密度目前五十六頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點“生物探針”的臨床比對評價結論：安度斯產(chǎn)品的綜合性能具有明顯優(yōu)勢。57目前五十七頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點八、G試驗的影響因素2023/5/1758目前五十八頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點1.檢測試劑的靈敏度1.1葡聚糖的量值與標準品2023/5/1759目前五十九頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點2023/5/1760

目前G試驗中葡聚糖采用的單位為重量單位“pg”。pg是一個非常非常微量的單位。因此G試驗是一項非常靈敏的生物檢測。當然，越是靈敏精確的檢測，越容易受到干擾。目前六十頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點目前葡聚糖沒有公認的標準物質！沒有國際標準品，沒有國家標準品，也沒有公認的行業(yè)標準品，只有企業(yè)的標準品（質控品）2023/5/1761目前六十一頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點各企業(yè)的葡聚糖標準品的來源不一。有的來自茯苓多糖，有的來自香菇多糖，有的來自海藻多糖。不同來源的葡聚糖對鱟試劑的活性不同。各企業(yè)的葡聚糖標準品效價不一。你的1pg可能相當我的10pg。相互之間無可比性。2023/5/1762目前六十二頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點無統(tǒng)一的標準品導致不同廠家試劑盒有不同的參考值。有的是10pg為陽性，有的是100pg為陽性。對參考值的表示各廠家也有所不同。有的以全血含量來表示，有的以檢測濃度來表示。2023/5/1763目前六十三頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點1.2試驗器具對G試驗有重要的影響！葡聚糖是自然界廣泛存在的一種物質，極容易污染到試驗器具。葡聚糖是一種非常穩(wěn)定的物質，通常的蒸煮高壓、輻照等滅菌手段不能徹底破壞葡聚糖。很難找到真正意義的無葡聚糖的器具。2023/5/1764目前六十四頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點G試驗使用到的實驗器具：采血針采血管（瓶）反應試管移液器具（吸頭）最主要的污染來自采血管！2023/5/1765目前六十五頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點重要建議最好使用廠家供應的專用采血管（瓶）其次是用經(jīng)廠家檢測合格的采血管不能使用未經(jīng)檢測的實驗器具2023/5/1766目前六十六頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點尊重科學，為患者負責！無效試驗是對患者最大的危害！2023/5/1767目前六十七頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點2.試劑的生物特異性

如前所述，G試驗的檢測試驗就是鱟試劑。鱟試劑可以對兩種物質反應，用于不同的用途。如下圖表示。

檢測內(nèi)毒素/脂多糖用于革蘭氏陰性菌檢測

鱟試劑

檢測葡聚糖（G試驗）用于真菌檢測2023/5/1768目前六十八頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點在檢測試劑制備上，應根據(jù)試劑的用途制備生物特異性強的檢測試劑，如：用于檢測細菌脂多糖的試劑，不能對葡聚糖產(chǎn)生反應。用于檢測真菌葡聚糖的試劑，不能對脂多糖產(chǎn)生反應。2023/5/1769目前六十九頁\總數(shù)七十七頁\編于十三點

遺憾的是，由于技術的原因，并不是所有廠家的試劑都具有生物特異性。有的試劑盒對LPS和-G都反應。有的試劑盒對非檢測對象低濃度時可能不反應，較高濃度時會反應。無生物特異性