HPLCfinal高效液相色譜分析

HPLCfinal高效液相色譜分析演示文稿目前一頁\總數四十七頁\編于十三點2HPLCfinal高效液相色譜分析目前二頁\總數四十七頁\編于十三點高效液相色譜是在氣相色譜和經典色譜的基礎上發(fā)展起來的?，F代液相色譜和經典液相色譜沒有本質的區(qū)別。

不同點僅是現代液相色譜比經典液相色譜有較高的效率

和實現了自動化

操作。高效液相色譜法是繼氣相色譜之后，70年代初期發(fā)展起來的一種以液體做流動相的新色譜技術。一、概述HPLC的特點目前三頁\總數四十七頁\編于十三點

特點：高壓、高速、高效、高靈敏度

高沸點、熱不穩(wěn)定的有機及生化試樣的高效分離分析方法。二、高效液相色譜法的特點

目前四頁\總數四十七頁\編于十三點影響色譜峰擴展及色譜分離的因素

高效液相色譜法的基本概念及理論基礎，如保留值、分配系數、分配比、分離度、塔板理論、速率理論等與氣相色譜法是一致的。而兩者的主要區(qū)別可歸結于流動相的不同。高效液相色譜的流動相為液體，而氣相色譜的流動相為氣體。目前五頁\總數四十七頁\編于十三點液體的擴散系數只有氣體的萬分之一至十萬分之一；液體的粘度比氣體大一百倍，而密度為氣體的一千倍。這些差別將對色譜過程產生影響。參數氣體液體擴散系Dm/cm2·s-1密度ρ/g·cm-3粘度η/g·(cm·s)-110-110-310-410-5110-2目前六頁\總數四十七頁\編于十三點1.渦流擴散項He與氣相色譜相同。2.縱向（分子）擴散項Hd式中：Cd為一常數；Dm為分子在流動相中的擴散系數。高效液相色譜中的速率方程式

由于分子在液體中的擴散系數比氣體中小4~5個數量級，因此在液相色譜中，當流動相的線速度大于0.5cm/s時，縱向擴散項對色譜峰的擴展的影響可以忽略。而氣相色譜中這一項卻是重要的。目前七頁\總數四十七頁\編于十三點

3.傳質阻力項（1）固定相傳質阻力：發(fā)生在液-液分配色譜中。式中：Cs是與容量因子有關的常數；Ds是試樣分子在固定液內的擴散系數；df是固定液膜的厚度。固定相傳質：試樣分子從流動相進入到固定液內進行質量交換的傳質過程目前八頁\總數四十七頁\編于十三點（2）流動相傳質阻力a.流動的流動項中的傳質阻力項Hm式中：Cm是一個與容量因子有關的常數，其值取決于柱直徑、形狀和填充的填料結構。當柱填料規(guī)則排列并緊密填充時，Cm降低。dp為固定相粒度；Dm是試樣分子在流動相中的擴散系數。b.滯留的流動項中的傳質阻力項Hsm式中Csm是一與顆粒微孔中被流動相所占據部分的分數及容量因子有關的常數。目前九頁\總數四十七頁\編于十三點高效液相色譜中的速率方程式為：簡寫為：與氣相色譜的速率方程式一致，其主要區(qū)別在于縱向(分子)擴散項可以忽略不計，影響柱效的主要因素是傳質項。目前十頁\總數四十七頁\編于十三點GC的H-u曲線是一條拋物線，有一個最低點（最佳流速）；HPLC的H-u曲線是一條斜率不大的直線，這表示分子擴散項對H基本上沒有影響，這也說明HPLC分離可以在高的流動相流速下而不至于使柱效損失太多，從而可以實現快速分離。目前十一頁\總數四十七頁\編于十三點

在高效液相色譜中,液體的擴散系數僅為氣體的萬分之一，則速率方程中的分子擴散項B/u較小，可以忽略不計，即：

H=A+Cu

故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同。液體的粘度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，故降低傳質阻力是提高柱效主要途徑。討論——影響分離的因素與提高柱效的途徑目前十二頁\總數四十七頁\編于十三點

由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質。改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。1.固定相粒度目前十三頁\總數四十七頁\編于十三點2.流速

流速大于0.5cm/s時,H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。

3.固定相及分離柱氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術要求非常高的工作，一般很少自行制備。目前十四頁\總數四十七頁\編于十三點

固定相與流動相均為液體（互不相溶）；基本原理：組分在固定相和流動相間的分配；

流動相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性（正相

normalphase），反之，流動相的極性大于固定液的極性（反相

reversephase）。正相與反相的出峰順序相反；

固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；

化學鍵合固定相：（將各種不同基團通過化學反應鍵合到硅膠（擔體）表面的游離羥基上。

C-18柱（反相柱）。HPLC的主要類型及其分離原理一、液-液分配色譜目前十五頁\總數四十七頁\編于十三點

固定相：為固體吸附劑，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；

流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑。

基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；

適用于分離相對分子質量中等的油溶性試樣，對具有官能團的化合物和異構體有較高選擇性；

缺點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；二、液-固吸附色譜

目前十六頁\總數四十七頁\編于十三點固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂；

流動相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；

基本原理：組分在固定相上發(fā)生反復的離子交換反應；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關。親和力大，保留時間長；陽離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

應用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。三、離子交換色譜

目前十七頁\總數四十七頁\編于十三點原理：將一種（或多種）與溶質離子電荷相反的離子（對離子或反離子）加到流動相中使其與溶質離子結合形成疏水性離子對化合物，使其能夠在兩相之間進行分配；陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子；陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子；

反相離子對色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對離子Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動相，試樣離子X-進入流動相后，生成疏水性離子對Y+X-后；在兩相間分配。四、離子對色譜目前十八頁\總數四十七頁\編于十三點

離子色譜是在20世紀70年代中期發(fā)展起來的一種技術，其與離子交換色譜的區(qū)別是其采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術和電導檢測器，是測定混合陰離子的有效方法。

五、離子色譜目前十九頁\總數四十七頁\編于十三點離子交換原理，與傳統(tǒng)離子交換的不同點：采用交換容量非常低的特制離子交換樹脂為固定相；細顆粒柱填料，高柱效；采用高壓輸液泵；低濃度淋洗液或本底電導抑制（在分離柱后，采用抑制柱來消除淋洗液的高本底電導）；可采用電導檢測器，快速分離分析微量無機離子混合物；各種抑制裝置及無抑制方法的出現，發(fā)展迅速。1.離子色譜法原理目前二十頁\總數四十七頁\編于十三點（1）分析速度快

可在數分鐘內完成一個試樣的分析；（2）分離能力高在適宜的條件下，可使常見的各種陰離子混合物分離；例：使用雙柱法，在十幾分鐘內，可使七種陰離子完全分離。（3）分離混合陰離子的最有效方法（4）耐腐蝕，儀器流路采用全塑件，玻璃柱2.

離子色譜具有以下優(yōu)點目前二十一頁\總數四十七頁\編于十三點

固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分離。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。

可對相對分子質量在100-105范圍內的化合物按質量分離六、排阻色譜色譜目前二十二頁\總數四十七頁\編于十三點（1）全多孔型擔體由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見；現采用10μm以下的小顆粒，化學鍵合制備柱填料；

（2）表面多孔型擔體（薄殼型微珠擔體）

30~40μm的玻璃微球(實心)，表面附著一層厚度為1~2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量低；液相色譜固定相

1.液-液分配及離子對分離固定相目前二十三頁\總數四十七頁\編于十三點（3）化學鍵合固定相

化學鍵合固定相:用化學反應的方法通過化學鍵把有機分子結合到擔體表面，是目前應用最廣、性能最佳的固定相；a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—

C

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機溶劑，應用最廣；c.硅碳鍵型：≡Si—Cd.硅氮鍵型：≡Si—N目前二十四頁\總數四十七頁\編于十三點（1）傳質快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質快；（2）壽命長，化學鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；耐水、耐光、耐有機溶劑，穩(wěn)定；（3）選擇性好，可鍵合不同官能團，提高選擇性；（4）有利于梯度洗脫；存在著雙重分離機制：(鍵合基團的覆蓋率決定分離機理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；

化學鍵合固定相的特點目前二十五頁\總數四十七頁\編于十三點種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結構類型：全多孔型和薄殼型；粒度：5～10μm；

2.液-固吸附分離固定相

目前二十六頁\總數四十七頁\編于十三點

結構類別：（1）薄殼型離子交換樹脂

薄殼玻璃珠為擔體，表面涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相

薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團）

樹脂類別：（1）陽離子交換樹脂（強酸性、弱酸性）（2）陰離子交換樹脂（強堿性、弱堿性）3.離子交換色譜分離固定相目前二十七頁\總數四十七頁\編于十三點（1）軟質凝膠葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網狀結構；水為流動相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質凝膠苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機凝膠；非極性有機溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質凝膠多孔硅膠、多孔玻珠等；化學穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機械強度大，流動相性質影響小，可在較高流速下使用。可控孔徑玻璃微球，具有恒定孔徑和窄粒度分布。4.空間排阻分離固定相目前二十八頁\總數四十七頁\編于十三點

1.流動相特性（1）液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；（2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。液相色譜的流動相

目前二十九頁\總數四十七頁\編于十三點

按流動相組成分：單組分和多組分；

按極性分：極性、弱極性、非極性；

按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調整出峰時間。2.流動相類別目前三十頁\總數四十七頁\編于十三點

在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據。采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。

常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)3.流動相選擇目前三十一頁\總數四十七頁\編于十三點（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動相中應有適宜的溶解度，防止產生沉淀并在柱中沉積。（4）流動相同時還應滿足檢測器的要求。當使用紫外檢測器時，流動相不應有紫外吸收。4.選擇流動相時應注意的幾個問題目前三十二頁\總數四十七頁\編于十三點液相色譜儀器

目前三十三頁\總數四十七頁\編于十三點目前三十四頁\總數四十七頁\編于十三點高效液相色譜儀1.流程目前三十五頁\總數四十七頁\編于十三點(1)高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。應具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調、耐腐蝕等特性2.主要部件目前三十六頁\總數四十七頁\編于十三點(2)梯度淋洗裝置外梯度（低壓梯度）:

常壓下將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后用高壓泵送入色譜柱。內梯度（高壓梯度）:利用兩臺高壓輸液泵增壓后，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。目前三十七頁\總數四十七頁\編于十三點(3)進樣裝置流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置目前三十八頁\總數四十七頁\編于十三點

柱體為直型不銹鋼管，內徑1~6mm，柱長5~40cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。(4)高效分離柱目前三十九頁\總數四十七頁\編于十三點

a.紫外檢測器應用最廣，對大部分有機化合物有響應。特點：靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容積8μL）；對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。

(5)液相色譜檢測器目前四十頁\總數四十七頁\編于十三點光電二極管陣列檢測器:

紫外檢測器的重要進展；1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三