ELISA檢測技術(shù)演示文稿

ELISA檢測技術(shù)演示文稿目前一頁\總數(shù)二十三頁\編于十二點(diǎn)ELISA檢測技術(shù)目前二頁\總數(shù)二十三頁\編于十二點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-LinkedImmunosorbentTest,ELISA)

：基于抗原-抗體反應(yīng)的特異性和等比例性，是酶免疫測定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附（包被）在固相載體(聚苯乙烯微量反應(yīng)板，也稱酶標(biāo)板

)表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，加入相應(yīng)的酶底物后發(fā)生顏色反應(yīng)，通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)，通過顏色反應(yīng)的深淺檢測標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原含量的檢測技術(shù)。目前三頁\總數(shù)二十三頁\編于十二點(diǎn)ELISA的發(fā)展概況

自從Engvall和Perlman（瑞典，1971）首次報道建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）以來，由于ELISA技術(shù)具有快速、敏感、簡便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，使其得到迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，將利用基因工程技術(shù)制備的抗原或單克隆抗體包被酶標(biāo)板后，極大地提高了ELISA檢測技術(shù)的特異性，加之電腦化程度極高的ELISA檢測儀的使用，使ELISA更為簡便實(shí)用和標(biāo)準(zhǔn)化，從而使其成為最廣泛應(yīng)用的檢測方法之一。目前，ELISA檢測技術(shù)在科學(xué)研究、疾病診斷、檢驗(yàn)檢疫、環(huán)境監(jiān)測等諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。目前四頁\總數(shù)二十三頁\編于十二點(diǎn)ELISA的基本原理

酶分子與抗體或抗抗體分子共價結(jié)合，此種結(jié)合不會改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過分光光度計(jì)進(jìn)行定量測定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。基本原理目前五頁\總數(shù)二十三頁\編于十二點(diǎn)ELISA試劑盒的組成完整的ELISA試劑盒通常包含以下各組分：

（1）已包被抗原或抗體的固相載體（俗稱酶標(biāo)板）；

（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（酶標(biāo)記物）；

（3）酶的底物；

（4）參考標(biāo)準(zhǔn)品（定量試劑盒）及其稀釋液；

（5）酶標(biāo)記物及樣本的稀釋液；

（6）洗滌液（通常為濃縮液，用前按比例稀釋）；

（7）反應(yīng)終止液；（8）封口膜若干、說明書一份。目前六頁\總數(shù)二十三頁\編于十二點(diǎn)酶標(biāo)板目前七頁\總數(shù)二十三頁\編于十二點(diǎn)ELISA常用酶類辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)DH2+H2O2D+H2O

上式中，DH2為供氫體，H2O2為受氫體。常用底物：

1.鄰苯二胺(OPD)，產(chǎn)物為橙紅色（492nm檢測）；

2.四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，產(chǎn)物為藍(lán)色，酸性條件下變?yōu)?/p>

黃色（450nm檢測）。反應(yīng)終止液：HCl或H2SO4溶液。目前八頁\總數(shù)二十三頁\編于十二點(diǎn)堿性磷酸酶(alkalinephosohatase,AP)常用底物：

1.對硝基苯磷酸酯(p-NPP)，產(chǎn)物為黃色的對硝基酚

（405nm檢測）；

2.發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于熒光測定，靈敏度高于顯色底物的方法。反應(yīng)終止液：NaOH溶液。目前九頁\總數(shù)二十三頁\編于十二點(diǎn)ELISA所需儀器設(shè)備恒溫箱洗板機(jī)酶標(biāo)儀目前十頁\總數(shù)二十三頁\編于十二點(diǎn)ELISA的類型和方法半定量ELISA試驗(yàn)定量ELISA試驗(yàn)試驗(yàn)?zāi)康脑囼?yàn)性質(zhì)間接法雙抗夾心法(直接夾心法)BAS-ELISA雙夾心法(間接夾心法)競爭法ELISA直接法目前十一頁\總數(shù)二十三頁\編于十二點(diǎn)

直接法ELISA是將酶標(biāo)抗原或抗體直接與包被在酶標(biāo)板上的抗體或抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗原-抗體復(fù)合物，加入酶反應(yīng)底物，測定產(chǎn)物的吸光值，計(jì)算出包被在酶標(biāo)上的抗體或抗原的量（見后圖）。該方法可用于檢測抗體或抗原。

直接法ELISA優(yōu)點(diǎn):1.特異性高、準(zhǔn)確性好；

2.實(shí)驗(yàn)操作簡便，用時短。缺點(diǎn):1.應(yīng)用范圍較小，生產(chǎn)難度大。

——需制備各種酶標(biāo)抗原或抗體。目前十二頁\總數(shù)二十三頁\編于十二點(diǎn)間接法ELISA

間接法ELISA是將酶標(biāo)記在二抗上，當(dāng)抗體（一抗）和包被在酶標(biāo)板的抗原結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物后，再以酶標(biāo)二抗和復(fù)合物結(jié)合，通過測定酶反應(yīng)產(chǎn)物的顏色可以（間接）反映一抗和抗原的結(jié)合情況，進(jìn)而計(jì)算出抗原或抗體的量（見后圖）。該方法可用于抗體檢測，是目前檢測抗體最常用的ELISA方法。優(yōu)點(diǎn):1.適用范圍廣，無需制備特殊的酶標(biāo)抗體;2.制備方便，價格便宜。目前十三頁\總數(shù)二十三頁\編于十二點(diǎn)雙抗夾心法ELISA

雙抗夾心法是先將未標(biāo)記的抗體包被在酶標(biāo)板上，用于捕獲抗原，在用酶標(biāo)的抗體與抗原反應(yīng)形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加入酶反應(yīng)底物，測定產(chǎn)物的吸光值，計(jì)算出捕獲的抗原量，本方法也稱為直接夾心法（見后圖）。

該方法可用于抗原檢測，例如細(xì)胞因子、激素、蛋白質(zhì)、細(xì)菌、病毒等，是目前檢測抗原最常用的ELISA方法。優(yōu)點(diǎn):1.適用范圍廣，無需制備特殊的酶標(biāo)抗體。

2.制備方便，價格便宜。目前十四頁\總數(shù)二十三頁\編于十二點(diǎn)雙夾心法ELISA

雙夾心法是先將未標(biāo)記的抗體包被在酶標(biāo)板上，用于捕獲抗原，然后用未標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng)形成抗體-抗原-未標(biāo)記抗體復(fù)合物；再應(yīng)用酶標(biāo)二抗和抗體-抗原-未標(biāo)記抗體復(fù)合物結(jié)合，形成抗體-抗原-未標(biāo)記抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，也稱為間接夾心法（見后圖）。

該方法可用于抗原檢測，例如蛋白質(zhì)、病原體等。優(yōu)點(diǎn):1.靈敏度高。

2.制備方便，無需制備特殊的酶標(biāo)抗體。缺點(diǎn):實(shí)驗(yàn)操作較復(fù)雜。目前十五頁\總數(shù)二十三頁\編于十二點(diǎn)目前十六頁\總數(shù)二十三頁\編于十二點(diǎn)BAS-ELISA

BAS-ELISA即生物素-親和素系統(tǒng)（biotinavidinsystem,BAS）ELISA法：是先將抗體包被在酶標(biāo)板上，用于捕獲抗原，然后用生物素（biotin）標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng)形成抗體-抗原-生物素標(biāo)記抗體復(fù)合物，再依次加入親和素、酶標(biāo)記生物素（或直接加入酶標(biāo)記的親和素），最后加底物顯色。

生物素是一種生長因子，廣泛分布于動、植物體內(nèi)，又稱輔酶R或維生素H。親和素由四個亞單位組成，對生物素具有高度親和力，即一個親和素可以結(jié)合4個生物素分子。因此，本方法具有信號放大功能（特點(diǎn)）。

該方法可用于抗原、抗體以及DNA和RNA（生物素）檢測。目前十七頁\總數(shù)二十三頁\編于十二點(diǎn)BAS-ELISA實(shí)驗(yàn)原理目前十八頁\總數(shù)二十三頁\編于十二點(diǎn)競爭法ELISA

競爭法ELISA的實(shí)驗(yàn)原理：將包被了抗體的酶標(biāo)板的微孔分為測定孔和對照孔，在對照孔中加入已知濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液和酶標(biāo)記物（酶標(biāo)抗原）；在測定孔中同時加入酶標(biāo)抗原和待檢樣本（抗原），酶標(biāo)抗原和樣品互相競爭包被抗體的結(jié)合點(diǎn)，形成酶標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物固定在微孔內(nèi)，沒有吸附的酶標(biāo)抗原通過洗滌去除，加入底物后，復(fù)合物上的酶催化底物生成有色產(chǎn)物。當(dāng)測定孔內(nèi)的樣本不含抗原時，固相上的抗體將和酶標(biāo)抗原結(jié)合，加入底物后顯色較深；當(dāng)樣本含有抗原時，樣本中的抗原和酶標(biāo)抗原共同競爭抗體的結(jié)合位點(diǎn)。酶標(biāo)抗原結(jié)合的比例越高，說明結(jié)合在固相抗體上的待測抗原就越少，反之亦然；在一定的條件下，復(fù)合物上酶的量和酶產(chǎn)物呈現(xiàn)的色澤成正比，用分光光度計(jì)進(jìn)行測定，從而計(jì)算出參與反應(yīng)的抗原和抗體的量，從而進(jìn)一步得知樣本中抗原的多少。目前十九頁\總數(shù)二十三頁\編于十二點(diǎn)測定孔EEEEE酶標(biāo)記物底物溶液對照孔EEEEEEEEEEEEEEE酶標(biāo)記物底物溶液參考液(不含抗原)EE樣本(含抗原)競爭法ELISA實(shí)驗(yàn)原理目前二十頁\總數(shù)二十三頁\編于十二點(diǎn)半定量ELISA試驗(yàn)?zāi)壳岸豁揬總數(shù)二十三頁\編于十二點(diǎn)間接法檢測血清HBsAb含量設(shè)計(jì)加板次序(空孔、陰、陽)加板(陰、陽、樣)37℃,30min加酶標(biāo)抗體(空孔除外)洗滌3次，拍干加底物溶液(空孔除外)37℃,10-30min加終止液(空孔除外)避光上機(jī)檢測、結(jié)果判定(空孔調(diào)零)37℃,30min洗滌3次，拍干目前二十二頁\總數(shù)二十三頁\編于十二點(diǎn)雙抗