生物催化與轉(zhuǎn)化的應(yīng)用實(shí)例

關(guān)于生物催化與轉(zhuǎn)化的應(yīng)用實(shí)例第1頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月D-泛解酸內(nèi)酯是D-泛酸鈣與D-泛醇的重要手性中間體。

OHOO第2頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月維生素藥物——D-泛酸和D-泛醇

D-泛酸，Pantothenicacid，又稱遍多酸、維生素B5、或B3，是構(gòu)成輔酶A的成分，它是一種重要的藥物、食品添加劑和飼料添加劑。產(chǎn)品一般為其鈣鹽D-泛酸鈣（CalciumPantothenate）。

D-泛醇（D-panthenol），又稱維生素原B5，是以液體形式存在的D-泛酸鈣的同效物，D-泛醇進(jìn)入人體內(nèi)能轉(zhuǎn)化為泛酸，進(jìn)而合成輔酶A，促進(jìn)人體蛋白質(zhì)、脂肪、糖類的代謝，保護(hù)皮膚和粘膜，改善毛發(fā)光澤，防止疾病的發(fā)生。因此，D-泛醇作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑，特別適用于醫(yī)藥、食品、化妝品行業(yè)。第3頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.1D-泛解酸內(nèi)酯的生物制備方法1.1.1不對(duì)稱還原酮基泛解酸內(nèi)酯以近平滑假絲酵母Candidaparapsilosis及小紅酵母Rhodotorulaminuta為催化劑，葡萄糖作為能源，進(jìn)行還原反應(yīng)，在28℃，pH4～6下反應(yīng)兩天，還原率達(dá)到100%，反應(yīng)液中產(chǎn)品D-泛解酸內(nèi)酯的濃度達(dá)到50～90

g/L，光學(xué)純度達(dá)到94%～98%e.e.。

第4頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.1.2不對(duì)稱還原酮基泛解酸與以前面的酮基泛解酸內(nèi)酯還原方法相比較，酮基泛解酸還原方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：①酮基泛解酸還原酶的產(chǎn)生菌都屬于Agrobacterium屬，而許多屬的微生物具有酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶的活性。②酮基泛解酸還原酶的光學(xué)選擇性很高（98%

e.e.以上），而酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶的光學(xué)選擇性與產(chǎn)生該酶的微生物所在屬或者種無(wú)關(guān)。這些結(jié)果表明催化酮基泛解酸還原的酶為單一酶（可能是酮基泛解酸還原酶），而酮基泛解酸內(nèi)酯的還原酶可能是多種具有不同光學(xué)選擇性的還原酶共同作用的。

第5頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.1.3不對(duì)稱氧化和還原兩步酶法轉(zhuǎn)化消旋泛解酸內(nèi)酯

Nocardiaasteroides可以不對(duì)稱氧化DL-泛解酸內(nèi)酯中的L-型成酮基泛解酸內(nèi)酯，酮基泛解酸內(nèi)酯又可以由Candidaparapsilosis不對(duì)稱還原成D-泛解酸內(nèi)酯。在這個(gè)兩步酶催化反應(yīng)體系中，D-型的泛解酸內(nèi)酯始終沒(méi)有被修飾，而是L-型的泛解酸內(nèi)酯經(jīng)過(guò)兩步微生物酶催化，最終變成了D-型。

第6頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

OHOO可以用來(lái)代替Candidaparapsilosis，與Nocardiaasteroides共同進(jìn)行反應(yīng)，它可以在酮基泛解酸內(nèi)酯自發(fā)水解為酮基泛解酸后，將其不對(duì)稱還原成D-泛解酸，D-泛解酸再酯化得到D-泛解酸內(nèi)酯。這一系列反應(yīng)用洗滌過(guò)的細(xì)胞可在同一生物反應(yīng)器內(nèi)一步轉(zhuǎn)化完成。

第7頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月OOOHOHOHCOOHOOOH+內(nèi)酯化，消旋化DL-PLL-PAD-PL用L-立體專一性內(nèi)酯水解酶水解，將L-泛解酸內(nèi)酯水解為L(zhǎng)-泛解酸，可直接得到未水解的D-泛解酸內(nèi)酯。L-泛解酸可以回收，經(jīng)過(guò)消旋化反應(yīng)得到DL-泛解酸內(nèi)酯重新用于拆分。

第8頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月+消旋化OOOHDL-PLOOOHL-PLOHOHCOOHD-PAOOOHD-PL內(nèi)酯化用鐮孢霉菌Fusarium等微生物選擇性水解DL-泛解酸內(nèi)酯生成D-泛解酸，分離后的D-泛解酸在酸性條件下加熱，轉(zhuǎn)化為D-泛解酸內(nèi)酯。

第9頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的串珠鐮孢霉菌Fusarium

moniliformeSW-902，用于發(fā)酵生產(chǎn)的菌絲體作酶源，水解DL-泛解酸內(nèi)酯中的D-泛解酸內(nèi)酯，分離得到D-泛解酸，再經(jīng)過(guò)內(nèi)酯化反應(yīng)，可得到很高光學(xué)純度的D-泛解酸內(nèi)酯。該方法不要求水解徹底，反應(yīng)時(shí)間短，得到產(chǎn)品D-泛解酸內(nèi)酯的光學(xué)純度高，工藝控制簡(jiǎn)單，反應(yīng)容易控制，底物的濃度可以很高。此項(xiàng)技術(shù)已在浙江鑫富生化公司實(shí)施產(chǎn)業(yè)化。異丁醛等D-泛酸鈣D-泛醇內(nèi)酯水解酶1.2工業(yè)化水解酶制備D-泛解酸內(nèi)酯介紹第10頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月D-泛解酸內(nèi)酯的酶法拆分工藝流程L-泛解酸內(nèi)酯DL-泛解酸內(nèi)酯異丁醛，甲醛，HCN消旋化反應(yīng)D-泛解酸微生物酶D-泛解酸內(nèi)酯內(nèi)酯化反應(yīng)orD-泛酸鈣D-泛醇第11頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月應(yīng)用例2微生物法制備抗抑郁藥R-托莫西汀中間體的研究第12頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.1研究意義具有特定功能基團(tuán)的手性醇是用于合成手性藥物和其他手性化學(xué)品重要的中間體。3-氯-1-苯丙醇是一種重要的手性藥物中間體。光學(xué)純的3-氯-1-苯丙醇可用于制備S-(+)-氟西汀，R-(-)-托莫西汀，(±)-尼索西汀。S-(+)-氟西汀是R-(+)-氟西汀藥效的3倍；R-(-)-托莫西汀是消旋體托莫西汀藥效的2倍，是S-(-)-托莫西汀藥效的9倍。以上三種藥物均為抗抑郁藥，可通過(guò)下圖制備。第13頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月由3-氯-1-苯丙醇制備手性抗憂郁藥

第14頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.1菌種的篩選

菌種SaccharomycesP2SaccharomycesB5Candida104Candida1257產(chǎn)率(%)305048100光學(xué)純度(ee%)7410010033*第15頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)準(zhǔn)品的GC分析圖譜A：3-氯-1-苯丙酮（31.166min），B：S-3-氯-1-苯丙醇（42.613min）第16頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月SaccharomycesB5還原底物的GC圖譜A：3-氯-1-苯丙酮（31.166min），C:R-3-氯-1-苯丙醇(44.022min)min303234363840424446pA93.594.595.596.597.5CA第17頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月以乙醇為共底物有助于輔酶再生的機(jī)理

第18頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月微生物的培養(yǎng)條件及反應(yīng)條件對(duì)還原反應(yīng)的影響

strains

ReactionconditionAnoxybioticcultureOxybioticcultureYield(%)ee(%)yield(%)ee(%)shaking0/50100standing0/28100

Candida104shaking0/48100standing0/26100Saccharo-mycesB5

第19頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月還原反應(yīng)中微生物的重復(fù)利用重復(fù)利用次數(shù)SaccharomycesB5Candida104yield(%)ee(%)yield(%)ee(%)1511004810025010048100350100471004371000/50/0/第20頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月S--氰基-3-苯氧基芐醇(S-CPBA)的合成與應(yīng)用應(yīng)用例3第21頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3-苯氧基苯甲醛（mPBA）的不對(duì)稱羥氰化反應(yīng)

手性金屬?gòu)?fù)合物

生物堿催化

多肽催化

醇腈酶（Oxynitrilases）或醇氰裂解酶（hydroxynitrilelyases）

催化劑:3.1拆分制備S-CPBA的過(guò)程第22頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月S-醇腈酶催化拆分合成S-CPBA脂肪酶催化選擇性水解合成S-CPBA第23頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

酶催化不對(duì)稱酯化拆分合成S-CPBA酶催化不對(duì)稱醇解合成S-CPBA第24頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月其中R為：

化學(xué)-酶催化一鍋化合成S-CPBA

第25頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月脂肪酶催化醇解反應(yīng)拆分（R，S）-CPBAc反應(yīng)式第26頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.2酶反應(yīng)體系的確定

酶反應(yīng)時(shí)間反應(yīng)溶劑底物醇S-CPBAmPBA(mmol/l)Yield%e.e.%2228hrTHF甲醇48.7499.168.97乙醇49.9899.057.68二氯甲烷甲醇35.5998.9530.34乙醇34.8799.1124.11乙醚甲醇50.1396.1317.22乙醇50.7797.6912.432430hrTHF甲醇49.6095.3720.58乙醇46.2296.1515.4氯仿甲醇20.4691.5762.65乙醇21.3892.7355.34甲苯甲醇26.5274.0297.88乙醇20.8775.1992.55第27頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月無(wú)溶劑體系酶催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)式

應(yīng)用例4第28頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月應(yīng)用例5

生物催化法制備手性2-芳基丙酸

第29頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5.12-芳基丙酸概述

2-芳基丙酸類非甾體抗炎藥(Non-SteroidAnti-InflammingDrugs，NSAIDs)，是一類重要的消炎鎮(zhèn)痛藥，可用化學(xué)通式ArCH(CH3)COOH表示。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有解熱、消炎鎮(zhèn)痛作用的2-芳基丙酸類藥物有幾十種，大多數(shù)已經(jīng)工業(yè)化生產(chǎn)。常見(jiàn)的品種有：萘普生(Naproxen)、布洛芬(Ibuprofen)、氟比洛芬(Flurbiprofen)、酮基布洛芬(Ketoprofen)、舒洛芬(Suprofen)等等。以酮基布洛芬為例，其消炎鎮(zhèn)痛作用比阿司匹林強(qiáng)150倍，解熱作用強(qiáng)100倍，臨床上用于治療慢性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、變形關(guān)節(jié)炎、外傷和術(shù)后疼痛。

第30頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第31頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月酶催化水解拆分芳基丙酸酯反應(yīng)示意圖脂肪(酯)酶或催化抗體研究發(fā)現(xiàn)來(lái)源于根霉（Rhizopus）、毛霉（Mucor）和假絲酵母（Candida）屬的胞外脂肪酶均對(duì)不同的萘普生酯具有很高的立體選擇性，且穩(wěn)定性和底物耐受性很高（>1mol/L）。

5.2酶法拆分工藝第32頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

酶催化水解拆分芳基丙腈（酰胺）反應(yīng)示意圖

腈水解酶腈水合酶酰胺酶其路線主要有兩條：一是用微生物腈水解酶(Nitrilase)直接立體選擇性水解拆分2-芳基丙腈為光學(xué)純的2-芳基丙酸；二是腈水合酶(NitrileHydratase)和酰胺酶(Amidase)相結(jié)合立體選擇性水解拆分2-芳基丙腈為光學(xué)純的2-芳基丙酸。第33頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月酶催化酯化

酶催化酯化反應(yīng)拆分2-芳基丙酸反應(yīng)示意圖來(lái)源于Candidarugosa、Rhizomucormiehei、Candidaantarctica等的脂肪酶均可用于2-芳基丙酸酯化的拆分。如Novo公司的Lipozyme1000L(來(lái)源于Rhizomucormiehei)用于催化(R,S)-布洛芬與辛醇的選擇性酯化反應(yīng)，優(yōu)先選擇(S)-構(gòu)型，對(duì)映選擇率(E)>100;不過(guò)對(duì)于酮基布洛芬，優(yōu)先選擇(R)-構(gòu)型，而且E值僅有2.4。

第34頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月酶催化氧化微生物酶催化氧化芳基烷烴制備(S)-2-芳基丙酸示意圖酶催化氧化芳基丙醛制備(S)-布洛芬

微生物第35頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5.3(R,S)-萘普生酶法拆分

非水相酶促酯化拆分萘普生的技術(shù)路線

產(chǎn)品分離消旋非水介質(zhì)+ROH,Lipase水解S-萘普生第36頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

酶促選擇性水解萘普生酯的技術(shù)路線

第37頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5.4布洛芬(ibuprofen)酶法拆分

+ROH,Lipase非水介質(zhì)產(chǎn)品分離水解消旋S-布洛芬非水相酶促酯化拆分布洛芬的技術(shù)路線

第38頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

酶促選擇性水解布洛芬酯的技術(shù)路線

第39頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

(S)-布洛芬的提取工藝

水解反應(yīng)液鹽酸酸化石油醚提取

水相有機(jī)相丟棄5%NaOH溶液反應(yīng)水相有機(jī)相鹽酸酸化石油醚提取

水相有機(jī)相丟棄S(+)-布洛芬R(-)-布洛芬乙酯布洛芬消旋乙酯

第40頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5.5酮洛芬(Ketoprofen)酶法拆分+ROH,Lipase產(chǎn)品分離水解消旋非水相酶促酯化拆分酮洛芬的技術(shù)路線

第41頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

乙醇乙醇Novozym4351,2-二氯丙烷總產(chǎn)率：60%Novozym4351,2-二氯丙烷OCOOHOCOOEtOCOOHOCOOHOCOOHOCOOHOCOOR(+)-1,(500g)(-)-2,ee55%(322g)(+)-1,ee77%(209g)(+)-1,(209g)(+)-1,ee38%(418g)(+)-1,ee96%(209g)(-)-2,ee20%(232g)大規(guī)模的制備（S）-酮基布洛芬

第42頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

OCOOHOCOOROCOOHOCOOROCOONaOCOOR+酯化lipase，水解分離有機(jī)相水相消旋化1234+酶促選擇性水解酮洛芬酯的技術(shù)路線

第43頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月應(yīng)用例6L-苯丙氨酸的酶法制備

第44頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6.1L-苯丙氨酸的性質(zhì)用途

苯丙氨酸純品為白色粉末，有苦味，微溶于醇，不溶于苯，熔點(diǎn)283℃，比旋光[α]D25=－34.4（c=1，H2O）。25℃時(shí)在水中溶解度是2.97g/100g。等電點(diǎn)為pH5.48。結(jié)構(gòu)式：L-苯丙氨酸是人體必需的八種氨基酸之一，作為一種營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑，是配制氨基酸輸液和制劑及氨基酸營(yíng)養(yǎng)食品的主要成份，L-苯丙氨酸目前最大的用途是用于天苯二肽甜味劑的合成，其中阿斯巴甜的世界銷量為4萬(wàn)噸/年。阿斯巴甜以安全、美味、低熱值、高甜度而成為優(yōu)秀的無(wú)糖甜味劑。

第45頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6.2L-苯丙氨酸的酶法制備路線

苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶酶法

第46頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

肉桂酸酶法(苯丙氨酸解氨酶（PLA）)

芐基海因酶法橫關(guān)健三等以苯甲醛和海因?yàn)樵虾铣傻玫紻L-芐基海因，在L-海因酶和N－氨甲酰水解酶的作用下酶法水解得到L-苯丙氨酸，該路線的關(guān)鍵是前體芐基海因的低成本制備和高活性L-海因酶的篩選。

第47頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月苯丙酮酸脫氫酶法以苯丙酮酸為前體，通過(guò)還原性氨化作用合成L-苯丙氨酸。1987年，Asano等人采用從自然界中分離到的尿素芽孢八疊球菌（Sporosurcinaureae）SCRC-R04所生產(chǎn)的高活性苯丙氨酸脫氫酶，與用于輔酶NADH再生的甲酸脫氫酶組成共軛反應(yīng)體系，L-苯丙氨酸產(chǎn)率達(dá)到116g/L，轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到89%。工藝路線示意如下：

第48頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月藥用氨基酸：

L-色氨酸、L-蛋氨酸等1969年日本千鈾一郎首先在工業(yè)上應(yīng)用固定化氨基?；覆鸱諨L-氨基酸獲得成功。被稱為酶工程的開(kāi)始。有些氨基酸發(fā)酵法很難，酶工程方法是目前推崇的方法第49頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化轉(zhuǎn)氨反應(yīng)生產(chǎn)L-苯丙氨酸

以苯丙酮酸和L-天門冬氨酸為原料，用天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，生成L-苯丙氨酸和草酰乙酸，草酰乙酸脫羧生成丙酮酸和二氧化碳。反應(yīng)式右圖。

L-天冬氨酸

E.coliSW0209-31第50頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月應(yīng)用例7酶法制備D-氨基酸

第51頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月7.1D-氨基酸的應(yīng)用

（1）多肽抗生素

短桿菌肽A

第52頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生長(zhǎng)抑制素八肽類似物(oxtreotide)，用于治療VIP瘤、類癌綜合癥及胃泌素瘤等醋酸奧曲肽(sandostatinacetate，商品名：善得定),用于治療肢端肥大癥、胰瘺、腫瘤激素性腹瀉的肽激素分泌失調(diào)、非腫瘤性腹瀉，治療胃切除后發(fā)生的腹瀉綜合癥。第53頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月半合成抗生素以D-HPG或D-PG為側(cè)鏈的半合成抗生素，因其肽鍵很難被β-內(nèi)酰胺酶作用從而具有較高的穩(wěn)定性，而且具有抗菌譜廣、毒性小、過(guò)敏性低、吸收快、血濃度高、藥力持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、口服效果好等遠(yuǎn)優(yōu)于青霉素G的藥理性能。第54頁(yè)，課件共64頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月肽類甜味劑具有很高的商業(yè)價(jià)值。目前市售的天苯二肽（商品名阿斯巴甜，aspartame）是一種優(yōu)良的甜味劑，其甜度為蔗糖的200倍，適用于肥胖癥、糖尿病和心血管病人食用。但它不適合苯丙酮酸尿患者，并且對(duì)酸堿和溫度穩(wěn)定性差，限制了其在食品領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。由D-Ala與L-Asp反應(yīng)合成得到的天丙二肽（商品名阿力甜，alitame），其甜度為蔗糖的2,000倍，且對(duì)熱和酸堿穩(wěn)定，可廣泛適用于食品工業(yè)、日用化學(xué)工業(yè)作甜味劑，具有極好的市場(chǎng)前景。1983年由BrennanT.M.獲得的阿力甜