蛋白質的分離純化及雙向電泳

關于蛋白質的分離純化及雙向電泳第1頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質的兩性離解和電泳現(xiàn)象蛋白質的膠體性質蛋白質的沉淀作用蛋白質的變性蛋白質的紫外吸收一、蛋白質的性質第2頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月一、蛋白質的性質蛋白質與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點。在等電點時(IsoelectricpointpI)，蛋白質的溶解度最小，在電場中不移動。在不同的pH環(huán)境下，蛋白質的電學性質不同。在等電點偏酸性溶液中，蛋白質粒子帶負電荷，在電場中向正極移動；在等電點偏堿性溶液中，蛋白質粒子帶正電荷，在電場中向負極移動。這種現(xiàn)象稱為蛋白質電泳(Electrophoresis)。1蛋白質的兩性離解和電泳現(xiàn)象第3頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳蛋白質在等電點pH條件下，不發(fā)生電泳現(xiàn)象。利用蛋白質的電泳現(xiàn)象，可以將蛋白質進行分離純化。第4頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月由于蛋白質的分子量很大，它在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質溶液具有膠體溶液的典型性質，如丁達爾現(xiàn)象、布郎運動等。由于膠體溶液中的蛋白質不能通過半透膜，因此可以應用透析法將非蛋白的小分子雜質除去。2蛋白質的膠體性質第5頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關。改變溶液的條件，將影響蛋白質的溶解性質在適當?shù)臈l件下，蛋白質能夠從溶液中沉淀出來。3蛋白質的沉淀作用第6頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月在溫和條件下，通過改變溶液的pH或電荷狀況，使蛋白質從膠體溶液中沉淀分離。在沉淀過程中，結構和性質都沒有發(fā)生變化，在適當?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀?？赡娉恋硎欠蛛x和純化蛋白質的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等。3蛋白質的沉淀作用可逆沉淀第7頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質的結構和性質，產生的蛋白質沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質的結構和性質的變化，所以又稱為變性沉淀。如加熱沉淀、強酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。3蛋白質的沉淀作用不可逆沉淀第8頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質的性質與它們的結構密切相關。某些物理或化學因素，能夠破壞蛋白質的結構狀態(tài)，引起蛋白質理化性質改變并導致其生理活性喪失。這種現(xiàn)象稱為蛋白質的變性(denaturation)。4蛋白質的變性第9頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質的變性變性蛋白質通常都是固體狀態(tài)物質，不溶于水和其它溶劑，也不可能恢復原有蛋白質所具有的性質。所以，蛋白質的變性通常都伴隨著不可逆沉淀。引起變性的主要因素是熱、紫外光、激烈的攪拌以及強酸和強堿等。第10頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月大部分蛋白質均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。這三種氨基酸的在280nm附近有最大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質在280nm附近顯示強的吸收。利用這個性質，可以對蛋白質進行定性鑒定。5蛋白質的紫外吸收第11頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月二、蛋白質分離和純化研究蛋白質的結構、性質和功能，首先需要得到純的蛋白質樣品。(1)蛋白質來源：微生物細胞、動物細胞和植物細胞；(2)隨時測定蛋白質活性并檢測蛋白質含量。(3)分離和純化過程都必須在溫和的條件下進行。第12頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月1．蛋白質的分離步驟(1)生物組織的機械破碎。常用的方法有研磨法、超聲波法、凍融法和酶解法等。(2)根據蛋白質的特性，選擇不同的溶劑進行抽提。水溶性蛋白用中性緩沖溶液抽提，酸性蛋白用稀堿性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性劑抽提等。(3)粗提:離心除去固體雜質后，可通過沉淀法、超濾法、萃取法等處理，得到蛋白質粗制品。(4)精制：可用層析法、電泳法等進行精制。(5)成品加工：測定蛋白質的性質并干燥成成品。第13頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月2．蛋白質的純化方法根據蛋白質的親水膠體性質，當其環(huán)境發(fā)生改變時，蛋白質會發(fā)生沉淀作用(Precipitation)。因為蛋白質分子量大小不同、表面所代電荷不同、表面的親水和疏水區(qū)域不同，所以可以通過可逆沉淀法將蛋白質分離出來。沉淀法具有部分純化、濃縮特點。(1)沉淀法第14頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月沉淀法膜分離法萃取法層析法電泳法2．蛋白質的純化方法第15頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月2．蛋白質的純化方法蛋白質在高濃度的中性鹽溶液中，由于水化層被破壞和表面電荷被中和，容易發(fā)生沉淀陰離子化合物的效果是：NH4+>K+>Na+陽離子化合物的效果是：PO43->SO42->Cl-常用的鹽為硫酸銨。不同的蛋白質由于所帶的電荷和水化程度不同，鹽析時所需的鹽的濃度也不相同，因而可以將不同的蛋白質加以分離。(1)沉淀法鹽析第16頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月2．蛋白質的純化方法在蛋白質溶液中，加入一定量的與水互溶的有機溶劑，由于這些溶劑與水的親和力強，能夠破壞蛋白質的水化層，使蛋白質的溶解度降低而沉淀。常用的有機溶劑有乙醇、甲醇和丙酮等。為了防止蛋白質在分離過程中發(fā)生變性，有機溶劑濃度不能太高(30%-50%)，而且需要在低溫條件下進行。(1)沉淀法有機溶劑沉淀法第17頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月2．蛋白質的純化方法蛋白質分子在等電點時，凈電荷為零，分子之間的靜電排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。當?shù)鞍踪|混合物溶液的pH被調到某一成分的等電點時，則該蛋白質大部或全部將沉淀出來。而那些等電點高于或低于該pH的蛋白質仍然留在溶液中。該法適用于在等電點pH穩(wěn)定的蛋白質。(1)沉淀法等電點沉淀法第18頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月2．蛋白質的純化方法Dialysis此法是利用蛋白質分子不能透過半透膜，而使它與其它小分子化合物，如無機鹽、單糖、雙糖、氨基酸、小肽以及表面活性劑等分離。常用的半透膜有玻璃紙或高分子合成材料，截止分子量一般為一萬。（2）膜分離法透析法第19頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月2．蛋白質的純化方法透析是將待純化的蛋白質溶液裝在用半透膜制成的透析袋內，再將透析袋放入透析液（通常是蒸餾水或緩沖液）中進行透析。通透動力為半透膜兩側的物質濃度差。（2）膜分離法透析法第20頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月2．蛋白質的純化方法超過濾技術是在一定的密封容器，施加一定壓力使一定分子量的物質透過超濾膜。其中包括有：中空纖維超濾器、圓筒式超濾器、板式超濾器。超濾膜的截止分子量有100萬、50萬、30萬、10萬、5萬、1萬、5千和1千（2）膜分離法超過濾法第21頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月2．蛋白質的純化方法超過濾法第22頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月2．蛋白質的純化方法兩種親水性高分子或一種高分子聚合物與一種鹽溶液混合后，因疏水性差異而分層。不同的蛋白質在疏水層的溶解能力不同而被萃取。目前主要采用兩種體系聚乙二醇－葡聚糖聚乙二醇－磷酸鉀（3）萃取法雙水相萃取法第23頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月2．蛋白質的純化方法由于蛋白質表面電荷性質、疏水性質不同，用有機溶劑、表面活性劑、水構成的反相膠束提取某些蛋白質。將表面活性劑溶解于有機溶劑中，等體積加入到蛋白質水溶液內，混合后可使某些蛋白質萃取到反相膠束內。（3）萃取法反相膠束萃取法第24頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月2．蛋白質的純化方法最常用的是二氧化碳，在78.3Mpa壓力下，CO2處于液體狀態(tài)，溫度為31.1°C，當壓力或溫度發(fā)生改變時，CO2處于氣－液中間態(tài)，具有溶劑性能，可以使許多蛋白質及有機物質溶解在某一狀態(tài)。經過泵出、升溫等步驟即可分離出來。（3）萃取法超臨界流體萃取法第25頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月2．蛋白質的純化方法（3）萃取法超臨界流體萃取法第26頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月2．蛋白質的純化方法此法是利用離子交換樹脂作為柱層析支持物，將帶有不同電荷的蛋白質進行分離的方法。離子交換樹脂可以分為陽離子交換樹脂（如羧甲基纖維素等），陰離子交換樹脂（如二乙基氨基乙基纖維素等）。帶正電荷多的蛋白質與樹脂結合較強，而帶正電荷少的蛋白質與樹脂結合則較弱。用不同濃度的陽離子洗脫液，如NaCl溶液進行梯度洗脫，通過Na+的離子交換作用，可以將帶有不同正電荷的蛋白質進行分離。（4）層析法離子交換層析法第27頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月2．蛋白質的純化方法（4）層析法離子交換層析法第28頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月2．蛋白質的純化方法此法又稱為分子篩層析。凝膠過濾所用的介質是由交聯(lián)葡萄糖、瓊脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝膠珠。凝膠珠的內部是多孔的網狀結構。Sephadex-葡聚糖凝膠G10-G200Sepharose-瓊脂糖凝膠2B,4B,6BSephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝膠S100,S200,S300,S400（4）層析法凝膠過濾法第29頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月2．蛋白質的純化方法（4）層析法凝膠過濾法第30頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月2．蛋白質的純化方法利用蛋白質表面存在的疏水區(qū)域的強度、大小不同，而被吸附到連接有疏水基團的層析介質上。離子強度增大可增強吸附能力，因此常常在2mol/L或3mol/LNaCl溶解樣品，洗脫時可通過降低鹽濃度、增加乙二醇濃度進行梯度洗脫。正丁基-Sepharose、正辛基-Sepharose苯基-Sepharose（4）層析法疏水層析第31頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月2．蛋白質的純化方法這是一種高效分離純化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白質分子對于固定化在載體上的特殊配基具有不同的識別和結合能力。選擇與待純化蛋白質具有特殊識別和結合作用的配基，然后應用化學方法將該配基與載體共價連接。將這種連接有配基的載體裝入層析柱中，當含有待純化的蛋白質溶液通過層析柱時，該蛋白質即與配基發(fā)生特異性結合而被吸附在層析柱上，而其它蛋白質則流出柱外。被特異性結合在層析柱上的蛋白質，可以用適當?shù)呐潴w洗脫液洗脫。（4）層析法親和層析法第32頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月2．蛋白質的純化方法

常用的配基有抗體、抗原、激素或受體蛋白、酶的底物和抑制劑等。層析柱載體為瓊脂糖凝膠等。（4）層析法親和層析法第33頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月2．蛋白質的純化方法在外電場的作用下，帶電顆粒將向著與其電性相反的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。蛋白質溶液的pH值不等于等電點時，蛋白質顆粒均帶有不同的電荷。由于不同蛋白質的分子量不同，所帶的電荷不同，因而在電場中移動的速度也不相同。在外加電場作用下，帶電的蛋白質顆粒在電場中移動的速度（v）取決于電場強度(E)，所帶的凈電荷(q)以及與介質的摩擦系數(shù)(f)。（5）電泳法第34頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月2．蛋白質的純化方法SDS（十二烷基磺酸鈉）是一種陰離子型表面活性劑，它能夠與蛋白質多肽鏈中的氨基酸殘基按大約12比例結合。這樣，每一個蛋白質分子都因為結合了許多的SDS而帶有大量的負電荷，而蛋白質分子原有的電荷則可以忽略。由于所有的蛋白質顆粒都帶有大量的負電荷，而且它們的電荷密度也大體相同，因此，Eq值接近一個常數(shù)。所以該法主要利用了蛋白質分子量大小不同而分離蛋白質。用已知分子量的蛋白質作為標準，則可以估算出不同蛋白質的分子量。（5）電泳法SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法第35頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月2．蛋白質的純化方法將兩性電解質(pH3-9,或其它范圍的如pH5-7)同蛋白質樣品一起加入到已經鋪好的凝膠上，在電場下，兩性電解質首先達到它的等電點而平衡，蛋白質樣品根據它自身的等電點分別向兩極移動，最后也達到平衡。（5）電泳法等電聚焦第36頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月3.蛋白質含量的測定定氮法：靈敏度較低雙羧脲法：樣品量0.2-1.7mg/LFolin-Lowry法：在堿性條件下磷鉬酸、磷鎢酸混合試劑與酪氨酸上的酚發(fā)生反應，生成藍色化合物，將其與雙羧脲法結合起來，蛋白質形成兩種顏色的混合物老綠色，在650nm具有特定的吸收。靈敏度較高25g-250g/ml.第37頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月考馬斯亮藍法（Bradford法）

考馬斯亮藍G250是一種帶有負電荷的染料，在酸性條件下，可與蛋白質上的正電荷結合，形成藍色化合物，在595nm具有特定吸收，反應簡便、快速、靈敏度高，5-50g/ml.紫外吸收法由于核酸在260nm具有光吸收，對測定干擾較大，可采用280nm、260nm同測法。蛋白質濃度mg/ml＝1.45A280-0.74A260第38頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月4.蛋白質純度等的測定純度和分子量的測定：采用電泳（如聚丙烯酰胺凝膠電泳，梯度凝膠電泳等）、高速離心、分子篩層析、高效液相色譜等技術測定。等電點的測定：利用等電聚焦方法測定。亞基個數(shù)的測定：采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳方法測定。第39頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月雙向電泳簡介及其在園藝學中的應用第40頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月第41頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月第42頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月第43頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月第44頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月第45頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月第46頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月第47頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月第48頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月生物學問題的提出實驗模型的設計實驗組和對照組樣品的制備蛋白樣品的IEF和PAGE電泳分離圖像掃描和初步分析感興趣蛋白點的切取胰酶對脫色后蛋白質的消化質譜的多肽指紋圖、微測序分析質譜結果的生物信息學分析和比對新蛋白質的發(fā)現(xiàn)其它實驗的進一步驗證蛋白信息的初步獲得蛋白質組分析流程第49頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質組研究的基本技術路線蛋白質樣品的制備雙向電泳圖像分析轉印至膜上的蛋白凝膠中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白質質量N端測序肽序列質譜數(shù)據肽指紋圖數(shù)據搜索新的或已知蛋白蛋白轉錄后修飾的鑒定第50頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月第51頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月第52頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月第53頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月第54頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月第55頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月第56頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月第57頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月第58頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月第59頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月氮脅迫條件下稻瘟病菌致病性分泌蛋白的鑒定項目編號：31060021起止時間：2011年1月-2013年12月第60頁，課件共68頁，創(chuàng)作于2023年2月利用二維凝膠電泳技術（2DE）和定量質譜技術對氮脅迫與非氮脅迫條件下該稻瘟病菌分泌蛋白表達譜進行研究,通過肽質量指紋圖譜（PMF）和蛋白質數(shù)據庫同源性分析對差異蛋白進行鑒定,結合稻瘟病菌全基因組測序結果和生物信息學資源,分析出其中具有信號肽,屬于典型分泌蛋白的基因,經RT-PCR擴增克隆后,利用購自Invitrogen公司的酵母表達系統(tǒng)獲得有生物活性的分泌蛋白。將該蛋白接種國際水稻所（