蛋白質(zhì)沉淀技術(shù)

蛋白質(zhì)沉淀技術(shù)一、蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)蛋白質(zhì)是人體機(jī)能構(gòu)成成分,人體任何器官和組織都是以蛋白質(zhì)作為重要組成成分。鑒于蛋白質(zhì)重要性研究蛋白質(zhì)分離十分必要。1、膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)表面有一些親水基團(tuán)易起水合作用，從而形成水化層，導(dǎo)致蛋白質(zhì)顆粒不易聚集沉淀，這些蛋白質(zhì)分子直徑在2～20nm范圍，所以蛋白質(zhì)溶液是親水膠體，具有半通透性，丁達(dá)爾效應(yīng)、布朗運(yùn)動(dòng)等一些親水膠體性質(zhì)①

。[1]楊豐科.系統(tǒng)有機(jī)化學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2003·433一435.2、兩性解離和等電點(diǎn)蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)包括末端α-氨基和末端α-羧基及可解離側(cè)鏈R基。這些可解離基團(tuán)在特定的PH范圍內(nèi)解離，產(chǎn)生帶正電荷或者帶負(fù)電荷的基團(tuán)。當(dāng)溶液PH使蛋白質(zhì)所帶正電荷與負(fù)電荷恰好相等，即蛋白質(zhì)分子本身凈電荷為零，此時(shí)PH即為該蛋白質(zhì)分子等電點(diǎn)，用PI表示，測(cè)PI時(shí)一定在緩沖液中進(jìn)行，因?yàn)殡x子強(qiáng)度可以使PI改變①。[1]楊豐科.系統(tǒng)有機(jī)化學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2003·433一435.兩性解離和等電點(diǎn)3、沉淀作用沉淀是指在溶液中加入沉淀劑使溶質(zhì)溶解度降低，形成固相從溶液中析出從而達(dá)到分離的一種技術(shù)。沉淀分離方法和其他分離方法相比，優(yōu)點(diǎn)是過(guò)程簡(jiǎn)單、成本低、原料易得，便于小批量生產(chǎn)，在產(chǎn)物濃度愈高的溶液中沉淀越有利、收率越高；缺點(diǎn)為過(guò)濾困難、產(chǎn)品質(zhì)量較低，需重新精制。4、變性作用天然蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素影響，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部維系其高級(jí)結(jié)構(gòu)原有氫鍵、鹽鍵等次級(jí)鍵遭到破壞，使分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致其生物學(xué)性質(zhì)、物理化學(xué)性質(zhì)改變，這種現(xiàn)象稱(chēng)為蛋白質(zhì)變性作用。5、凝固作用變性蛋白質(zhì)分子相互凝聚或相互穿插纏繞在一起的現(xiàn)象稱(chēng)為蛋白質(zhì)凝固，例如生雞蛋蛋白溶液受熱變?yōu)榈鞍讐K現(xiàn)象。6、顏色反應(yīng)蛋白質(zhì)顏色反應(yīng)實(shí)際上是氨基酸一些基團(tuán)肽鍵等與一定試劑所產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。二、蛋白質(zhì)沉淀分離技術(shù)蛋白質(zhì)膠粒上同性電荷互相排斥，不易凝聚成團(tuán)下沉；蛋白質(zhì)表面許多親水基團(tuán)水合作用形成一層水化膜,在膠粒之間起隔離作用，蛋白質(zhì)在水溶液中,雖分子量很大,但仍能維持穩(wěn)定溶解狀態(tài)。若能除去其水化膜并中和其電荷,則蛋白質(zhì)可從溶液中沉淀而出。常用有以下幾種沉淀方法：蛋白質(zhì)沉淀分離常用方法1、鹽析法2、有機(jī)溶劑沉淀法3、等電點(diǎn)沉淀法4、變性沉淀分離技術(shù)5、復(fù)合鹽沉淀法1、鹽析法（中性鹽沉淀）

一般來(lái)說(shuō),所有固體溶質(zhì)都可在溶液中加入中性鹽而沉淀析出,這一過(guò)程稱(chēng)之鹽析②。（1）中性鹽沉淀蛋白質(zhì)的基本原理

a.高濃度鹽離子使蛋白質(zhì)表面雙電層厚度降低，靜電排斥作用減弱。b.中性鹽比蛋白質(zhì)具更強(qiáng)的親水性，因此將與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水分子。[2]李冬梅,張錦茹,田園.蛋白質(zhì)沉淀分離[J].糧食與油脂,2007·9一11鹽析法鹽析機(jī)理示意圖鹽析法（2）中性鹽的選擇原則a.要有較強(qiáng)的鹽析效果。一般來(lái)說(shuō)，陰離子影響鹽析的效果比陽(yáng)離子顯著，且含高價(jià)陽(yáng)離子的無(wú)機(jī)鹽比含低價(jià)陽(yáng)離子的無(wú)機(jī)鹽效果好。b.要有足夠大的溶解度，且溶解度受溫度影響盡可能地小。便于獲得高濃度的鹽溶液，尤其是在低溫時(shí)，不至于造成鹽結(jié)晶的析出。c.不影響蛋白質(zhì)等生物大分子的活性，并且，最好不引入給分離或測(cè)定帶來(lái)麻煩的雜質(zhì)。d.來(lái)源豐富，價(jià)格低廉。鹽析法常用的中性鹽有：(NH4)2SO4

，Na2SO4，NaH2PO4等。其中最重要的是(NH4)2SO4。優(yōu)點(diǎn)：①溶解度大；尤其是在低溫時(shí)仍有相當(dāng)高的溶解度②分離效果好；③有穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用，不易引起變性；④價(jià)格便宜；廢液可以肥田，不污染環(huán)境。缺點(diǎn)：硫酸銨水解后變酸，在高pH值下會(huì)釋放出氨，腐蝕性較強(qiáng)，因此，鹽析后要將硫酸銨從產(chǎn)品中除去。鹽析挨法（3）影翁響鹽型析的丑因素a.蛋白憤質(zhì)濃概度一般刻較適貞當(dāng)?shù)拿悠肥碀舛雀闶?.應(yīng)5%豪-3宅.0偏%，通佩過(guò)實(shí)靈驗(yàn)確博定。b.離子聞強(qiáng)度顫和類(lèi)殃型一般走來(lái)說(shuō),離子程強(qiáng)度津越大,蛋白危質(zhì)溶秤解度陰越低跟。下面姐為幾丸種鹽翻鹽析棟能力呼排列鴿次序:磷酸揉鉀>硫酸計(jì)鈉>磷酸血銨>檸檬橡酸鈉>硫酸鍛鎂③[3雁]Ge晉la釋zk渡aV哲B升,S者mi站th姻D不D遮S捉,Le行dw灰ar勿dD饒A攀,e必t仙al架.豆In銹fl脆ue輕nc猛e專(zhuān)of玻h灶ig恩h稅pr稼es榆su崇re每o法n兆pr王ot炸ei挎n-糟po飽ly造sa鄉(xiāng)豐cc南ha瓜ri樣dein辯te牲ra蜂ct謠io屯ns噴[J]膽.Pr辰os危.I傾nt給.C藥on晚f,1香99災(zāi)8,污24顏:3損97詳-4炎00賴(lài).鹽析笛法c.葵pH值一般培來(lái)說(shuō),蛋白延質(zhì)所巷帶凈東電荷猾越多,溶解捧度越破大；宣凈電寶荷越則少,溶解盞度越變小,在等片電點(diǎn)景時(shí)蛋邪白質(zhì)乞溶解榨度最疾小,為提投高鹽忽析效妨率,多將混溶液pH值調(diào)員到目婦的蛋彈白等抖電點(diǎn)暈處。d.溫度在低傭離子份強(qiáng)度舟或純傍水中,蛋白圍質(zhì)溶清解度陶在一寫(xiě)定范趣圍內(nèi)儉隨溫頃度增趙加而巖增加;但在分高濃業(yè)度下,蛋白括質(zhì)、敢酶和潮多肚姓類(lèi)物坑質(zhì)溶尼解度錦隨溫搏度上備升而救下降膚。在最一般宗情況霜下,蛋白觀(guān)質(zhì)對(duì)模鹽析快溫度浴無(wú)特爬殊要摔求,可在漠室溫耽下進(jìn)等行,只有嗎某些套對(duì)溫晉度較房誠(chéng)敏感流酶要省求在0℃～4℃進(jìn)行太。鹽析棟法（4）脫騎鹽常用抖的脫螞鹽處貨理方口法有萄：透今析法浙、超畜濾及軟凝膠脖過(guò)濾小法。透析最早天應(yīng)用康的膜頑分離瞎技術(shù)算。2、有拆機(jī)溶拖劑沉往淀法（1）有尊機(jī)溶述劑沉肥淀機(jī)垮理：降低念水的毀介電敏常數(shù),導(dǎo)致吃具有歇表面門(mén)水層膀的生錢(qián)物大銀分子本脫水,相互漸聚集,最后傾析出摘。該法優(yōu)點(diǎn)在于：a.分辨睛能力它比鹽答析法悶高,即蛋使白質(zhì)挺只在捉一個(gè)選較窄疏有機(jī)茂溶劑倒?jié)舛却鲁劣鸬?b提.沉淀喬不用捆脫鹽嗓，過(guò)絮濾較剛為容界易。其缺點(diǎn)是對(duì)顫具有窯生物分活性胖大分逢子易艷引起謙變性爺失活,操作葉要求栗在低界溫下之進(jìn)行礎(chǔ)。總體賠來(lái)說(shuō),有機(jī)爪溶劑隨沉淀院法不贈(zèng)如鹽刮析法喬普遍②。[2慎]李冬宴梅,張錦憤茹,田穩(wěn)園.蛋白源質(zhì)沉糾淀分縱離[J反].糧食糠與油問(wèn)脂,2箭00嶺7·架9一11有機(jī)耐溶劑速沉淀伶法(2借)有機(jī)妻沉淀或劑有機(jī)繳沉淀奇劑有桿乙醇殃、甲神醇、拿丙酮書(shū)、二考甲基始甲酰挨胺、滅二甲嗎基亞谷砜、煌異丙挽酮等,其中回最常成用的趁是乙徹醇和笨丙酮袖。蛋妻白質(zhì)仍和酶穴的沉扣淀大熄多采延用乙恒醇,由于戴甲醇域、丙猜酮均綠有一客定毒愿性,故使挺用時(shí)些必須妹謹(jǐn)慎渣。有機(jī)那溶劑幼沉淀砌法(3番)有機(jī)榨沉淀澆劑分障離技吵術(shù)的田影響盜因素溫度低溫，而且要保持溫度的相對(duì)恒定。樣品濃度蛋白質(zhì):0.5%-2%;黏多糖1%-2%pH保證待沉淀物穩(wěn)定的前提下，接近等電點(diǎn)離子強(qiáng)度重要因素，一般以0.01mol/L-0.05mol/L為宜金屬離子鈣離子、鋅離子等，可與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物有機(jī)鍋溶劑踩沉淀夜法(4崗)應(yīng)用僅實(shí)例應(yīng)用鴿實(shí)例靠有高成粱蛋撕白質(zhì)挪的提蕩取,其基斑本工桃藝流們程為:高梁旨粉→可萃取血→離果心→褲沉淀筐→水鹽洗→盯烘干[4攝][4簡(jiǎn)]張偉盡敏,譚小漫蓉,鐘爸耕.高粱循蛋白搜質(zhì)研巾究進(jìn)惠展[J能].糧食酸與油仙脂,2滅00透5(嫌1)猴:7廢-衣9.3、等織電點(diǎn)押沉淀薪法（1）等纖電點(diǎn)駝沉淀赤法的胳原理等電熱點(diǎn)(pI)是兩各性物誰(shuí)質(zhì)在芬其質(zhì)新點(diǎn)的毅凈電麗荷為嬸零時(shí)湯介質(zhì)螺的pH值,溶質(zhì)恒凈電核荷為瓶零，趨分子子間排貫斥電滴位降漂低，把吸引獵力增像大，旅能相紐奉互聚武集起哲來(lái)，揭沉淀睬析出邊，此狂時(shí)溶腰質(zhì)的夏溶解旁度最廣低。等電送點(diǎn)沉騎淀法（2）等好電點(diǎn)課沉淀眉法的剖影響事因素a.雜質(zhì)厘種類(lèi)娃的影信響混合岔液中歷存在鉛許多到等電肺點(diǎn)相龍近的甜兩性煩電解址質(zhì)，季單獨(dú)詳使用任此法浮效果脅差。b.離子西強(qiáng)度照的影航響蛋白眼質(zhì)有奴鹽溶民和鹽煎析兩辦面性耗，等庫(kù)電點(diǎn)夢(mèng)的數(shù)沃值隨握著溶壘液中刮中性琴鹽離向子的烘種類(lèi)苦和濃言度變滲化而累變化敲，所地以離傾子強(qiáng)藍(lán)度對(duì)致等電確點(diǎn)的干沉淀配作用挎影響億較大碧。c.溶質(zhì)廁表面條極性茅的影關(guān)響等電凳點(diǎn)沉間淀法場(chǎng)適合紫于疏澇水性賭較大寨的蛋兵白質(zhì)倦（如誤酪蛋卸白）偷，因傷其表奇面水牲化層辜相對(duì)暢較薄執(zhí)。而透親水容性較量強(qiáng)的填蛋白弦質(zhì)在倚等電戶(hù)點(diǎn)下封不容鼻易產(chǎn)避生沉垮淀，拼這時(shí)需要桌結(jié)合延其他傅方法裂一起恢使用市。等電曾點(diǎn)沉惱淀法(3聚)應(yīng)用編實(shí)例應(yīng)用亮實(shí)例還有大犧豆蛋丑白的伯堿饑提酸稿沉法,基本令工藝棄流程切為:豆粕乒原料厭→二誓次堿偏提→占粗濾疼→酸萌沉→譽(yù)打漿管→回僑調(diào)→嗓改性忘→噴決粉→幻玉成品[5醬][5酒]高孔縫榮,黃惠部華,梁照賄為.食品鍵分離業(yè)技術(shù)[歪M巧]烈.廣州:華南咽理工棚大學(xué)界出版予社,宮19憐98居:易12畫(huà)-棍15驅(qū).4、變藍(lán)性沉兆淀分已離技郵術(shù)（1）基醋本原罩理利用醫(yī)生物否大分護(hù)子物乎質(zhì)對(duì)攪物理屋、化平學(xué)等姐外部挺環(huán)境使因子紙敏感哥性的記差異放而選冒擇性電地使?fàn)恳环N糖組分剖發(fā)生浩變性續(xù)形成悼沉淀,而另查一些瓣組分晌保持姨不變,從而鄉(xiāng)豐達(dá)到殘分離議、除產(chǎn)雜和決提純?cè)伒哪客械?。變性雕沉淀孟分離罪技術(shù)（2）變望性沉抱淀分旗離的凝方法a.熱變辛性沉俗淀分努離:利用拐蛋白兩質(zhì)熱棍穩(wěn)定沿性不皆同的妙特點(diǎn),使蛋吩白質(zhì)耳組分虹之間溉得以抽分離,同時(shí)卷使蛋厲白質(zhì)賀與水凱及其栽他可良溶物扮分離,此法身常用爹于組堂織化裂植物常蛋白娃的生誦產(chǎn)[6男]。[6概]張建鋒云,邱搜堅(jiān),李正閘紅,等.木豆蒙葉蛋溫白提哈取工啄藝研禮究[J柏]燙.西南厘林學(xué)魯院學(xué)乓報(bào),絡(luò)20杯01響,采21愚(列1)慚:激4隊(duì)0-虹4為4.變性垮沉淀存分離賞技術(shù)b.選擇疏性酸捉堿變海性沉置淀分宮離:利用跑酸堿裳變性釣原理,通過(guò)財(cái)調(diào)節(jié)針溶液pH值,可有泳選擇騾地去關(guān)除雜主蛋白,常用應(yīng)于生顆化制完備中[7晉]。c.利用蠟酶進(jìn)咱行變轟性分悼離:利用柔酶的士催化斬作用追使一行些蛋費(fèi)白質(zhì)銀變性,從而蝕沉淀冰分離,如凝鮮乳酶逢催化棗牛乳太酪蛋梅白的見(jiàn)沉淀宴。[7呈]劉氣芳,敖常膜偉.刺槐撞葉蛋簡(jiǎn)白提狗取工暢藝條怠件的洗初步鴉研究[J邁]螞.中南費(fèi)林學(xué)耐院學(xué)側(cè)報(bào),他19軟99搞,更19夠(愁1)限:跳6嬌4-葬6凱7.變性今沉淀類(lèi)分離脂技術(shù)d.利用仙表面躺活性丘劑或著有機(jī)沖溶劑望引起仆變性梢沉淀肌分離:在制耍備核賀酸時(shí),可加義入含狠水酚聞、氯澆仿以績(jī)及十男二烷擋基磺奪酸鈉她等試即劑,有選忌擇地澡使蛋恭白質(zhì)煮發(fā)生賽變性趙沉淀,達(dá)到忠去除磁雜質(zhì)薄、提展純核細(xì)酸的苦目的祖。變性霞沉淀蛾分離勺技術(shù)(3奴)影響漏蛋白直質(zhì)變火性的令因素a.溫度秀。在較箱高溫效度作昏用下,蛋白蝕質(zhì)的垮二級(jí)紫、三昂級(jí)和般四級(jí)蛋結(jié)構(gòu)守的弱僅鍵斷年裂,破壞耳了肽活鏈原欠來(lái)特鬼有的臣排列東和空著間結(jié)額構(gòu),使原殲來(lái)在顏大分減子內(nèi)械部的施極性撐基團(tuán)泉轉(zhuǎn)到末分子勉表面,促進(jìn)亦蛋白匙質(zhì)分勾子相獎(jiǎng)互凝貝集而遙沉淀,但溫餓度過(guò)即高又朋會(huì)使添蛋白起質(zhì)發(fā)患生變把性。變性治沉淀千分離流技術(shù)b.充pH值。大部值分蛋李白質(zhì)簡(jiǎn)在pH現(xiàn)4～10的范框圍內(nèi)水是比蒸較穩(wěn)仁定的,超過(guò)底這個(gè)滋范圍癢強(qiáng)酸韻或強(qiáng)浪堿會(huì)新使蛋根白質(zhì)嶼分子努內(nèi)的盤(pán)基團(tuán)姥帶電腔性質(zhì)士發(fā)生糕變化,從而此破壞飲靜電遙引力在所形蠢成的彈鍵,使原骨來(lái)的腔構(gòu)象窩發(fā)生宜變化,導(dǎo)致扭蛋白姑質(zhì)變病性c.其他慢化學(xué)洗因子舒。5、鹽輪復(fù)合得物沉姥淀法a.金屬財(cái)復(fù)合炮鹽法:許多秀有機(jī)笨物質(zhì)飾包括面蛋白替質(zhì)在取內(nèi),在堿吵性溶除液中孝帶負(fù)糧電荷,能與滾金屬膽離子雖形成京沉淀漁。根境據(jù)有切機(jī)物較與它摟們之浪間作辱用機(jī)微制,可分誤為羧卸酸、敢胺及鬼雜環(huán)病等含江氮化忌合物,如銅餅、鋅贊、鍋;親羧繁酸疏返含氮然化合邊物類(lèi),如鈣籌、鎂助、鉛;親硫才氫基?；蠣?zhēng)物類(lèi),如汞居、銀耽、鉛成等。庸蛋錄白質(zhì)激一金指屬離