北科大微生物培養(yǎng)基的配制及滅菌

北科大微生物培養(yǎng)基的配制及滅菌第一頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種廣泛用于培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基，屬于天然培養(yǎng)基（complexmedia,undefinedmedia）。其主要成分是牛肉膏、蛋白胨和NaCl。它們分別提供微生物生長繁殖所需要的碳源、氮源、能源、生長因子和無機(jī)鹽等。配天然培養(yǎng)基時可以用自來水，但自來水中常含Ca2＋，Mg2＋離子，可與其他成分形成沉淀。肉膏蛋白胨培養(yǎng)基第二頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五高氏合成一號培養(yǎng)基是一種用于培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基(definedmedia)。培養(yǎng)基中的可溶性淀粉作為碳源和能源，KNO3作為氮源，K2HPO4、MgSO4和FeSO4作為無機(jī)鹽（高價陽離子鹽需單獨(dú)滅菌后臨用前與含磷酸鹽的培養(yǎng)基混勻）。合成培養(yǎng)基必須用蒸餾水高氏合成一號培養(yǎng)基第三頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基是培養(yǎng)酵母菌及霉菌的一種優(yōu)良培養(yǎng)基，為半合成培養(yǎng)基(semi-definedmedia)。培養(yǎng)基配方出現(xiàn)的自然pH系指培養(yǎng)基不經(jīng)酸、堿調(diào)節(jié)而自然呈現(xiàn)的pH。豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基第四頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五馬丁培養(yǎng)基是選擇培養(yǎng)基，屬于半合成培養(yǎng)基，常用于從自然環(huán)境中分離真菌，其中的孟加拉紅能抑制細(xì)菌和放線菌的生長，而對于真菌的生長則沒有影響，另外，在使用前，向培養(yǎng)基中加入去氧膽酸鈉和鏈霉素(30u/ml)。去氧膽酸鈉為表面活性劑，防止霉菌菌絲蔓延，還可抑制G+細(xì)菌生長；鏈霉素對多數(shù)G－細(xì)菌具抑制生長作用。從而達(dá)到分離真菌的目的。馬丁培養(yǎng)基第五頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五產(chǎn)葡萄糖氧化酶菌株的篩選培養(yǎng)基葡萄糖氧化酶（GlucoseOxidase，E.C.1.1.3.4，簡稱GOD）

O2+C6H12O6+H2OC6H12O7+H2O2GOD葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶在生化檢測（葡萄糖）、面粉處理（過氧化氫對半胱氨酸的作用形成二硫鍵）、食品保鮮（去除氧氣）等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。第六頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五培養(yǎng)基——葡萄糖氧化酶平板篩選培養(yǎng)基(g·L-1)：

葡萄糖80，蛋白胨3，(NH4)2HPO40.39，KH2PO40.19，MgSO4·7H2O0.16，CaCO33.5，可溶性淀粉10，KI1.7，脫氧膽酸鈉0.2，瓊脂20，硫酸鏈霉素25000U。

葡萄糖氧化酶第七頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五產(chǎn)葡萄糖氧化酶的微生物大多為霉菌。加入脫氧膽酸鈉是為了抑制菌絲的形成以獲得不互相粘連的霉菌菌落。加入硫酸鏈霉素是為了抑制細(xì)菌的生長。葡萄糖氧化酶催化葡萄糖會生成葡萄糖酸，pH下降，可以通過CaCO3控制培養(yǎng)基的pH，并形成透明圈。葡萄糖氧化酶催化葡萄糖會生成過氧化氫，可以氧化KI生成I，使淀粉變色，從菌落周圍是否出現(xiàn)特異的淀粉藍(lán)色圈可以判斷出該菌是否產(chǎn)酶。第八頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五培養(yǎng)方法——葡萄糖氧化酶土壤霉菌分離：取土壤樣品5g，加入95mL的無菌水中，200r·min-1搖床振蕩1h。平板篩選培養(yǎng)：采用Fiedure.K.J顯色法。將富集培養(yǎng)后的土壤懸液，按不同稀釋度（10-2、10-3、10-4）接種于平板篩選培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3d。斜面培養(yǎng)：挑取平板培養(yǎng)基中藍(lán)色圈較大的菌株接種至斜面培養(yǎng)基，28℃恒溫，培養(yǎng)4d后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩u床培養(yǎng)：接種斜面保存的菌種于發(fā)酵培養(yǎng)基，250mL搖瓶50mL裝液量，28℃恒溫，200r·min-1旋轉(zhuǎn)搖床，培養(yǎng)2d。葡萄糖氧化酶第九頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五實(shí)驗(yàn)材料藥品：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、馬鈴薯、蔗糖、KNO3、K2HPO4、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、可溶性淀粉、葡萄糖，(NH4)2HPO4、KH2PO4、CaCO3

、KI、脫氧膽酸鈉、硫酸鏈霉素、(NH4)2SO4、K2HPO4、KCl、瓊脂等各種培養(yǎng)基的組成成分、0.1％孟加拉紅溶液，lmol/LHCl、lmol/LNaOH。高壓蒸汽滅菌器、電熱恒溫干燥箱、紫外線殺菌燈、電爐、天平其它：酒精燈、試管、稱量紙、牛角匙、燒杯、量筒、玻棒、pH試紙、玻璃珠、三角瓶、封口膜、無棉塞的空試管、培養(yǎng)皿、各種包裝紙、防水紙、繩索、棉花、記號筆、標(biāo)簽等。準(zhǔn)備無菌水，去離子水裝于250ml三角瓶中，每瓶95ml，放置3-5顆玻璃珠，121℃滅菌30min。第十頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

（玻璃器皿的洗滌和包裝）1．玻璃器皿的洗滌2．滅菌前玻璃器皿的包裝(1)培養(yǎng)皿的包裝(2)三角瓶的包裝第十一頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五過濾除菌抗生素等不耐熱物質(zhì)需要進(jìn)行過濾除菌。濾器和容器等一般需要進(jìn)行高溫滅菌。第十二頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

（液體及固體培養(yǎng)基的配制過程）稱量：按照配方正確稱取各種原料（除瓊脂外）放于有刻度的燒杯中。溶化：在燒杯中加入所需水量，玻棒攪拌，加熱溶解。定容：倒入一量筒中，補(bǔ)水至所需體積。調(diào)pH值：滴加1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)至所需pH，用pH試紙對照?！后w培養(yǎng)基配制完成！加瓊脂混勻：趁熱加入1.5％的瓊脂攪勻?！腆w培養(yǎng)基配制完成??！第十三頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五如果培養(yǎng)基中某種藥品用量太少，可以將其配制成較濃的溶液，然后按比例吸取一定體積溶液，加入至培養(yǎng)基中。固體培養(yǎng)基的配制：可以在配制好的液體培養(yǎng)基中加入適量的瓊脂粉，滅菌。未冷卻前取出，搖勻。第十四頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制1．培養(yǎng)基成分：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl0.5g，瓊脂1.5～2g，水100ml。pH7.52．配制方法：（1）分別稱取蛋白胨和NaCl的所需量，置于燒杯中，加入所需水量的2/3左右的蒸餾水。用玻棒挑取牛肉膏置于另一小燒杯中，進(jìn)行稱量。然后加入少量蒸餾水于小燒杯中溶解，（也可將小燒杯置于石棉網(wǎng)上適度加熱溶解），倒入上述燒杯中，用玻棒攪拌使藥品全部溶解。（2）加入所需量的瓊脂（液體培養(yǎng)基省略此步驟）（3）用1mol/LNaOH溶液調(diào)pH至7.5。（4）將溶液倒入量筒中，補(bǔ)充水量至所需體積。（5）分裝、加塞、包扎。（6）高壓蒸汽滅菌121℃滅菌20min。第十五頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五高氏合成一號培養(yǎng)基的配制1．培養(yǎng)基成分可溶性淀粉2g，KNO30.1g，K2HPO4·3H2O0.05g，MgSO4·7H2O0.05g，NaCl0.05g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.001g，瓊脂1.5～2g，水100ml，pH7.52．配制方法（1）稱量及溶化量取所需水量的2/3左右加入到燒杯中，置于石棉網(wǎng)上加熱至沸。稱量可溶性淀粉，置于另一小燒杯中，加入少量冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，然后倒入上述裝沸水的燒杯中，繼續(xù)加熱，使淀粉完全融化。分別稱量KNO3、NaCl、K2HPO4和依次逐一加入水中溶解。（培養(yǎng)基使用前每100ml培養(yǎng)基加入滅菌的1ml5％MgSO4，1ml0.1％FeSO4溶液。）（2）加入所需量的瓊脂（液體培養(yǎng)基省略此步驟）（3）用1mol/LNaOH溶液調(diào)pH至7.5。（4）將溶液倒入量筒中，補(bǔ)充水量至所需體積。（5）分裝、加塞、包扎。（6）高壓蒸汽滅菌121℃滅菌20min。第十六頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基的配制1．培養(yǎng)基成分黃豆芽10g葡萄糖5g瓊脂1.5～2g水100ml自然pH2．配制方法（1）稱新鮮黃豆芽10g，置于燒杯中，再加入100ml水，小火煮沸30min，用紗布過濾，補(bǔ)足失水，即制成10％豆芽汁。（2）配制時，按每100ml的10％豆芽汁加入5g葡萄糖，煮沸后加入瓊脂（液體培養(yǎng)基省略此步驟），補(bǔ)足失水。（3）分裝、加塞、包扎。（4）高壓蒸汽滅菌110℃滅菌20min。第十七頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五馬丁培養(yǎng)基的配制1．培養(yǎng)基成分

葡萄糖1g，蛋白胨0.5g，KH2PO4·3H2O0.1g，MgSO4·7H2O0.05g，0.1％孟加拉紅溶液0.33ml，瓊脂1.5～2g，水100ml，自然pH。2％去氧膽酸鈉溶液2ml（預(yù)先滅菌，臨用前加入）鏈霉素溶液（10,000u/ml）0.33ml（臨用前加入）2．配制方法

（1）稱量

稱取培養(yǎng)基各成分的所需量。

（2）溶化在燒杯中加入約2/3所需水量，然后依次逐一溶化培養(yǎng)基各成分。按每100ml培養(yǎng)基加入0.33ml的0.1％孟加拉紅溶液。

（3）加入所需瓊脂（液體培養(yǎng)基省略此步驟），補(bǔ)足水至所需體積。

（4）分裝、加塞、包扎。

（5）高壓蒸汽滅菌110℃滅菌20min。

（6）臨用前，加熱融化培養(yǎng)基，候冷至60℃左右，按每100ml培養(yǎng)基無菌操作加入2ml的2％去氧膽酸鈉溶液及0.33ml的鏈霉素溶液（10000u/ml），迅速混勻。第十八頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

（棉塞的制作及試管、錐形瓶的包扎）棉塞的制作。試管包扎。錐形瓶用封口膜包扎。第十九頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

（干熱滅菌法）將培養(yǎng)皿、吸管等玻璃器皿洗凈干燥后，用舊報紙包好，或裝入特制的鐵筒中(每個吸管用紙包好后裝入鐵筒)。包裝吸管時應(yīng)將吸取的一端放在取時先拆開的一端，防止取用時手觸及吸取端。將包裝好的玻璃儀器擺入電熱烘箱中，彼此間留有一定的空隙以便流通空氣。關(guān)緊箱門，打開電源。調(diào)節(jié)溫度160℃～170℃，滅菌1小時。待自然降溫冷卻后(60℃以下)才能開門取出玻璃器皿，避免由于溫度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。第二十頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（高壓蒸汽滅菌法）高壓蒸汽滅菌法是利用高壓來提高蒸汽的溫度，達(dá)到完全滅菌的目的。關(guān)好排水閥門放入去離子水至超過加熱管2－3cm為止，注意水量一定要加足，否則容易造成事故。將要滅菌的培養(yǎng)基、滅菌水等，包裝好后放入滅菌鍋中，關(guān)上器蓋，旋緊螺旋時，先將每個螺旋旋轉(zhuǎn)到一定程度(不要太緊)，然后再旋緊相對的兩個螺旋，以達(dá)到平衡旋緊，否則易造成漏氣，達(dá)不到徹底滅菌的目的。通電加溫，同時打開排氣閥門，排盡鍋內(nèi)的空氣，即閥門沖出的全部是蒸氣時則表示徹底，此時可關(guān)閉排氣閥門，如果過早關(guān)閉閥門，排氣不徹底，也達(dá)不到徹底滅菌的目的。壓力表的指針上升時，鍋內(nèi)溫度也逐漸升高，當(dāng)壓力表指針升至15磅（0.1MPa）時，蒸氣溫度相當(dāng)于120℃～121℃，此時開始計算滅菌時間，控制熱源，使處于15磅壓力保持20-30分鐘，即能達(dá)到完全滅菌的目的，然后停止加溫。對熱不穩(wěn)定的培養(yǎng)基如含有葡萄糖、氨基酸等物時，應(yīng)適當(dāng)降低壓力，延長時間（0.056MPa(112.6℃)滅菌30min）。滅菌時間一到，切斷電源，待壓力自然降至零、鍋內(nèi)蒸氣完全排盡時，打開鍋蓋取出培養(yǎng)基，如需制備固體斜面培養(yǎng)基時，則應(yīng)趁熱將試管斜放在桌上，冷卻后便可收起。最后將高壓滅菌器內(nèi)的剩余水排出。第二十一頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期五實(shí)驗(yàn)安排分為4類：1-2組制備細(xì)菌培養(yǎng)基（肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）；(8*100ml)3-5組制備放線菌培養(yǎng)基（高氏合成1號培