體外誘導(dǎo)臍血單核細(xì)胞分化為破骨樣細(xì)胞的研究

體外誘導(dǎo)臍血單核細(xì)胞分化為破骨樣細(xì)胞的研究【摘要】目的建立人破骨樣細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法，探討1α,25(OH)2D3、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(MCSF)、前列腺素E2(PGE2)等骨吸收刺激因子對(duì)破骨細(xì)胞分化、增殖和功能的影響，為進(jìn)一步研究正畸牙齒移動(dòng)的生物力學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法將臍血單核細(xì)胞接種于預(yù)置蓋玻片和骨片的24孔培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)組分別加入誘導(dǎo)因子1α，25(OH)2D3、MCSF、PGE2，對(duì)照組不加，每3d換液一次，培養(yǎng)7d。采用倒置相差顯微鏡、TRAP染色等方法觀察破骨樣細(xì)胞的形成情況。結(jié)果第3天實(shí)驗(yàn)組單核細(xì)胞出現(xiàn)融合趨勢(shì)，第7天TRAP染色可見陽(yáng)性的多核破骨樣細(xì)胞，但尚未形成骨吸收陷窩，以1α,25(OH)2D3組破骨樣細(xì)胞形成數(shù)量最多。結(jié)論臍血單核細(xì)胞經(jīng)1α,25(OH)2D3、MCSF、PGE2體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后可分化為TRAP(+)多核的破骨樣細(xì)胞，且10-8mol/L的1α，25(OH)2D3具有最強(qiáng)的生物學(xué)效應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】臍血單核細(xì)胞；破骨樣細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；1α,25(OH)2D3；MCSF；PGE2

Differentiationofosteoclastlikecellsinducedfromumbilicalcordbloodcellsinvitro

ABSTRACT:ObjectiveToestablishastableandusefulmethodforculturinghumanosteoclastlikecellsinvitro,andinvestigatetheeffectof1α,25(OH)2D3,MCSFandPGE2onosteoclastsdifferentiation,proliferationandactivationsoastolaythefoundationforfurtherstudyofthebiologicalmechanismfortoothmovement.MethodsTheHCMNCwereisolatedandculturedin24wellplatewithcoverslipsandhumandentineslices.Theexperimentgroupwasculturedwith1α,25(OH)2D3,MCSFandPGE2,respectively,whilethecontrolgroupwasnot.Theliquidwaschangedevery3daysandthewholecultureprocesslastedfor7days.ThephasecontrastmicroscopyandTRAPstainingwereadoptedtoidentifyosteoclastlikecells.ResultsOnthe3rddaythemonocytesbegantofuseandonthe7thdaypositivemultinucleatedcellscouldbeseenwithTRAPstaining,butabsorptionpitwasnotformedonthedentinslices.Thegroupwith1α,25(OH)2D3hadthelargestnumberofosteoclastlikecells.ConclusionAfterthemonocytesinUCBareculturedby1α,25(OH)2D3,MCSF,PGE2induction,theycanturnintoTRAP(+)multinucleateosteoclastlikecells,the1α,25(OH)2D310-8mol/Lbeingthemosteffective.

KEYWORDS:mononucleatedcellofumbilicalcordblood;osteoclast;cellculture;1α,25(OH)2D3;MCSF;PGE2

破骨細(xì)胞(osteoclastcells,OC)是具有獨(dú)特骨吸收功能的多核巨細(xì)胞，來(lái)源于造血細(xì)胞系，OC由單核細(xì)胞(mononucleatedcells,MNC)融合而成，不能增殖和傳代。破骨樣細(xì)胞(osteoclastlikecells,OLC)是指實(shí)驗(yàn)中原代培養(yǎng)或誘導(dǎo)生成的，具有OC性質(zhì)，用于細(xì)胞學(xué)或分子生物學(xué)研究的細(xì)胞。OLC與OC的不同是前者用于實(shí)驗(yàn)研究，而后者位于骨改建部位。體外培養(yǎng)OC，在MNC融合的過(guò)程中，受到多種細(xì)胞因子以及產(chǎn)生這些細(xì)胞因子的細(xì)胞及其相關(guān)刺激的影響，研究表明：1α,25(OH)2D3、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(MCSF)、前列腺素E2(PGE2)等是OC分化發(fā)育的關(guān)鍵因子，可支持血緣性MNC向OC分化。Fujikawa等[1]證明在人外周血中存在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞，而人臍血中含豐富的更原始的血緣性前體細(xì)胞，特別是粒單核系祖細(xì)胞(CFUGM)或CFU混合多核細(xì)胞集落含量高。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)臍血單核細(xì)胞(HCMNC)的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察1α，25(OH)2D3、MCSF以及PGE2對(duì)人OLC形成的影響。

1材料與方法

材料

實(shí)驗(yàn)對(duì)象非高危妊娠的健康孕婦，于胎兒娩出后、胎盤未完全娩出前自臍靜脈穿刺，無(wú)菌條件下收集臍帶血(UCB)，肝素抗凝。

主要試劑αMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(浙江金華生物制劑公司)，人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)蠊?，1α,25(OH)2D3(Sigma公司)，重組人MCSF(Sigma公司)，PGE2(Sigma公司)，萘酚ASBI磷酸鹽(Sigma公司)。

方法

玻片及骨磨片的處理將×蓋玻片超聲清洗后浸入硫酸－重鉻酸鉀溶液中過(guò)夜，高壓滅菌后備用。取新鮮牛股骨，制備成×厚100-200μm的骨片，超聲清洗10min×3次，浸入10倍雙抗中20min×3次，紫外線照射消毒后存放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

分離HCMNC取健康產(chǎn)婦抗凝UCB50mL，與PBS等體積混合；將稀釋血液以體積比1∶1沿管壁輕輕加于Ficoll液面上，使二者形成一個(gè)清晰的界面；2000r/min離心20min，吸取呈云霧狀的白膜層(主要含單個(gè)核細(xì)胞)，收集于離心管內(nèi)；用PBS洗3次，1000r/min離心5min，棄上清，加入含15%(體積分?jǐn)?shù))FBS的αMEM培養(yǎng)液重懸計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。

實(shí)驗(yàn)分組和誘導(dǎo)培養(yǎng)HCMNC將收集的HCMNC接種于預(yù)置蓋玻片和骨片的24孔培養(yǎng)板中，每孔加入HCMNC懸液，在37℃，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)2h，全量換液后分組加入誘導(dǎo)培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)分5組：A組為空白對(duì)照，不加任何誘導(dǎo)因子；B組加入1α，25(OH)2D31×10-8mol/L；C組加入1α，25(OH)2D31×10-7mol/L；D組加入MCSF20×10-6g/L；E組加入1α，25(OH)2D31×10-8mol/L和PGE21×10-6mol/L。每3d全量換液1次，培養(yǎng)7d。

細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察用倒置顯微鏡觀察貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞形態(tài)，融合現(xiàn)象以及多核細(xì)胞形成的情況。

TRAP染色取培養(yǎng)第7天的細(xì)胞爬片，用%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛固定液4℃固定10-15min，蒸餾水洗3次；浸入TRAP染色孵育液37℃，50min，雙蒸水洗3次；細(xì)胞爬片的面向下，中性樹膠封片，光鏡觀察。

骨吸收陷窩觀察取培養(yǎng)第7天的骨片經(jīng)%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛固定液固定7min，/L氫氧化銨超聲清洗1min×3次，系列酒精脫水，自然晾干，1%(體積分?jǐn)?shù))甲苯胺藍(lán)染液室溫染色4min，蒸餾水洗后光鏡下觀察。

OLC及骨吸收陷窩計(jì)數(shù)以TRAP染色(+)、細(xì)胞核≥2個(gè)的細(xì)胞為OLC，對(duì)培養(yǎng)第7天蓋玻片上的OLC進(jìn)行計(jì)數(shù)，每張玻片計(jì)數(shù)5個(gè)隨機(jī)視野(×200)，取其均值為每張玻片的OLC數(shù)。光鏡(×100)下對(duì)整張骨片作陷窩計(jì)數(shù)，每張骨片任選5個(gè)視野，記錄其均值，結(jié)果以陷窩數(shù)/骨片表示。所有數(shù)據(jù)均用±s表示，進(jìn)行多組間的單因素方差分析及t檢驗(yàn)，使用進(jìn)行計(jì)算。

2結(jié)果

細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察初培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞數(shù)量較多，2h后換液，去除了未貼壁的淋巴細(xì)胞，留下已貼壁生長(zhǎng)的MNC，未見到多核的成熟OC。A組：培養(yǎng)前3d，細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量未有明顯變化(圖1A)，第5天，細(xì)胞數(shù)量減少，可觀察到部分單核細(xì)胞的融合現(xiàn)象，第7天，可觀察到很少量的OLC，核的數(shù)目2-3個(gè)不等(圖1B)；B組：培養(yǎng)3d后，細(xì)胞數(shù)量減少，可觀察到單核細(xì)胞的融合現(xiàn)象，核大，數(shù)目2-5個(gè)不等，多核細(xì)胞數(shù)量開始增多(圖1C)，培養(yǎng)5d時(shí)，可見大量多核OLC，圓形或不規(guī)則形，胞體大，折光性強(qiáng)，有的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)偽足，核的數(shù)目3-20個(gè)不等(圖1D)；C、D、E組細(xì)胞的變化基本同B組。

TRAP染色結(jié)果培養(yǎng)第7天細(xì)胞作TRAP染色，顯微鏡下可見胞漿染為紅色，胞核呈淡黃色的TRAP(+)OLC。個(gè)別單核細(xì)胞也呈陽(yáng)性染色，可能為OC前體。A組可見少量TRAP(+)的細(xì)胞，細(xì)胞體積較小，多為2-3個(gè)細(xì)胞核(圖2A)；B、C、D、E組TRAP(+)的細(xì)胞數(shù)量明顯較A組多()，且多為5個(gè)以上細(xì)胞核(圖2B)，尤其在B組可見到有14個(gè)核的強(qiáng)陽(yáng)性破骨樣細(xì)胞，胞體大，多有偽足伸出(圖2C)；B組與C組間TRAP(+)細(xì)胞的數(shù)目差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義()，B組與D組，B組與E組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義()，D組與E組間TRAP(+)細(xì)胞的數(shù)目差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義()。

骨吸收陷窩觀察結(jié)果接種培養(yǎng)7d后的骨片，經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后各組均未觀察到典型的骨吸收陷窩。

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果各組OLC計(jì)數(shù)比較結(jié)果見表1。與A組相比，B、C、D、E組OLC數(shù)量明顯增多()，B組與D組，B組與E組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義()，而B組與C組及D組與E組間OLC的數(shù)目差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義()。

圖1培養(yǎng)破骨樣細(xì)胞倒置顯微鏡觀察

ObservationofphasecontrastmicroscopeforOLC(×400)

A:groupAculturedfor3days;B:groupAculturedfor7days;C:groupBculturedfor5days;D:groupBculturedfor7days(pseudopodiumoccurred).GroupA:Thecontrolgroup;GroupB:Thegroupwith1α,25(OH)2D31×10-8mol/L

圖2培養(yǎng)破骨樣細(xì)胞TRAP染色

ResultsofTRAPstainingforOLC

A:resultsofgroupA(×200);B:resultsofgroupB(×200);C:TRAP(+)multinucleateosteoclastlikecells(×400)

GroupA:thecontrolledgroup;GroupB:thegroupwith1α,25(OH)2D31×10-8mol/L

表1各組培養(yǎng)破骨樣細(xì)胞數(shù)比較

Table1Thenumberofmultinucleateosteoclastlikecellsinculturesystems

**vs.groupA;△△vs.groupB

3討論

OC是終末細(xì)胞，不能傳代，且生命周期短暫，體外培養(yǎng)非常困難。目前，體外分離培養(yǎng)OC的基本方法有3種：機(jī)械分離培養(yǎng)法、凝膠純化培養(yǎng)法和誘導(dǎo)培養(yǎng)法。其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)法多用于對(duì)OC的細(xì)胞生化和分子生物學(xué)研究，以往采用不同的誘導(dǎo)因子在成骨細(xì)胞(OB)的參與下從骨髓細(xì)胞、脾細(xì)胞及外周血單核細(xì)胞中誘導(dǎo)出OLC，實(shí)驗(yàn)步驟較為繁瑣。而本實(shí)驗(yàn)在沒有OB的情況下，采用1α，25(OH)2D3、MCSF、PGE2等骨吸收刺激因子誘導(dǎo)HCMNC，獲得大量TRAP(+)多核的OLC。

以往的大多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為：沒有OB的參與，在體外無(wú)法誘導(dǎo)出OLC。因?yàn)镺C表面不存在1α，25(OH)2D3、MCSF、PGE2等骨吸收刺激因子的受體，故不能對(duì)其直接發(fā)生反應(yīng)；而OB卻表達(dá)這些因子的受體，并能對(duì)這些因子發(fā)生反應(yīng)。因此這些促進(jìn)骨吸收的因子主要通過(guò)作用于OB，使OB表達(dá)骨吸收信號(hào)，并通過(guò)特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，作用于MNC和破骨細(xì)胞前體，從而發(fā)揮其生物活性的。然而，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：即使沒有OB存在，1α，25(OH)2D3、MCSF、PGE2等仍可以誘導(dǎo)HCMNC分化為TRAP(+)的多核OLC，但是這些OLC尚未具有骨吸收能力，其功能成熟的條件仍需進(jìn)一步研究。

1α，25(OH)2D3作為鈣、磷代謝的重要調(diào)節(jié)激素，在OC的分化發(fā)育中具有獨(dú)特的調(diào)節(jié)作用，體外培養(yǎng)條件下可支持臍血微環(huán)境中血緣性MNC向OC分化和功能成熟。Takahashi和李鐵軍等對(duì)小鼠的OC培養(yǎng)研究表明，1α，25(OH)2D3的效應(yīng)呈劑量依賴性，在高于10-9mol/L濃度的單一刺激下，骨髓細(xì)胞的混合培養(yǎng)可于第6天分化形成TRAP(+)多核細(xì)胞，在骨髓細(xì)胞培養(yǎng)中，MNC募集、融合并形成OLC的能力與1α，25(OH)2D3的濃度(10-6-10-10mol/L)呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B組與C組中所生成的OLC的數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)C組MNC開始融合的時(shí)間早于B組，然而B組TRAP(+)的細(xì)胞中，多核的OLC(核數(shù)≥9)數(shù)量較多。因此認(rèn)為，單純?cè)龃?α,25(OH)2D3的濃度并不會(huì)使OLC的數(shù)量增多，10-8mol/L的1α，25(OH)2D3具有最強(qiáng)的生物學(xué)效應(yīng)。

MCSF在OC形成中的作用存在較多爭(zhēng)論，Kacena認(rèn)為MCSF能夠刺激破骨前體細(xì)胞的分裂、增殖；Zaidi、Moonga等在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，如果在骨髓細(xì)胞培養(yǎng)中只加入核因子κB受體活化因子配體(RANKL)或MCSF一種因子時(shí)，不能生成具有骨吸收功能的OC，只有在同時(shí)加入RANKL和MCSF時(shí)，才可形成典型的OC。本實(shí)驗(yàn)D組中所形成的TRAP(+)細(xì)胞數(shù)目較A組增多，但是比B、C組細(xì)胞數(shù)量少，認(rèn)為可能是缺乏RANKL的協(xié)同作用所致。

PGE2對(duì)OC的分化具有雙重作用，低濃度的PGE2可誘導(dǎo)OC的分化，高濃度的PGE2對(duì)分離的OC有抑制作用，這可能是cAMP生成增加而引起的暫時(shí)性效應(yīng)。Udagawa等報(bào)道應(yīng)用10-6mol/L的PGE2誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞，培養(yǎng)7d，可明顯增加OC的數(shù)量。本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)1α，25(OH)2D3與PGE2聯(lián)用時(shí)，由于協(xié)同作用，可能使PGE2局部濃度過(guò)高，導(dǎo)致OC分化受到抑制，使得E組中TRAP(+)的細(xì)胞數(shù)量少于B、C組。

正畸牙移動(dòng)中的牙槽骨改建過(guò)程涉及多種細(xì)胞參與，其中OC和牙周膜細(xì)胞(PDLC)是兩種最重要的細(xì)胞。施加正畸力后，可以激活多個(gè)信號(hào)通路，刺激血緣性單核細(xì)胞分化發(fā)育為成熟的OC。其中，OPG/RANK/RANKL是OC分化成熟的最重要的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。目前，發(fā)現(xiàn)OC內(nèi)與RANKL相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有4條：NFκB通路、MAPK通路、PI3K/Akt通路和CN/NFAT通路[10]。

本實(shí)驗(yàn)在沒有OB參與的情況下，采用1α，25(OH)2D3、MCSF、PGE2等骨吸收刺激因子誘導(dǎo)HCMNC分化為TRAP(+)多核的OLC，建立了體外培養(yǎng)人OLC的簡(jiǎn)易方法。為研究施加正畸力后牙周膜微環(huán)境中PDLC和OC相互作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路奠定了基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步探討正畸牙齒移動(dòng)的生物力學(xué)機(jī)制提供了新的思路。

【參考文獻(xiàn)】

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李鐵軍，于世鳳，王曉敏，等.1,25－二羥基維生素D3對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞形成破骨細(xì)胞樣細(xì)胞及其骨吸收效應(yīng)的影響[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志,2000,6(3):12