蛋白質(zhì)含量測定

食品中蛋白質(zhì)含量測定（凱氏定氮法）一、 實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的原理。掌握凱氏定氮法的操作技術(shù)，包括樣品的消化處理、蒸餾、滴定及蛋白質(zhì)含量計算等。二、 實驗原理蛋白質(zhì)是含氮的化合物。食品與濃硫酸和催化劑共同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，留在消化液中，然后加堿蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后，再用鹽酸標準溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量來乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，即得蛋白質(zhì)含量。因為食品中除蛋白質(zhì)外，還含有其它含氮物質(zhì)，所以此蛋白質(zhì)稱為粗蛋白。消化：有機物中的胺根在強熱和CuSO4/K2SO4，濃H2SO4作用下，消化生成（NH4）2SO4；2NH3+H2S04+2H+=（NH4）2S04（其中CuSO4做催化劑）蒸餾：在凱氏定氮器中與堿作用，通過蒸餾釋放出NH3,收集于H3BO3溶液中；（NHXSO+2NaOH=2NH+2HO+N^SO.2NH3+4H3BO3=（NH4）.B4O7+5H.O滴定：用已知濃度的HCl標準溶液滴定，根據(jù)HCI消耗的量計算出氮的含量，然后乘以相應(yīng)的換算因子，既得蛋白質(zhì)的含量。（NHXBO+2HCl+5HO=2NHCl+4HBO.三、 儀器與試劑（一）試劑硫酸銅（CuSO4?5H2O）（催化劑）硫酸鉀（提高沸點）濃硫酸（A.R）硼酸溶液（2%）：稱量2g硼酸（H3BO3）粉末溶于蒸餾水100mL，（容量瓶）定容100mL氫氧化鈉溶液（30%）：30克氫氧化鈉溶于蒸餾水（容量瓶）定容100mL0.01mol/L鹽酸標準滴定溶液?；旌现甘驹噭?.1%甲基紅乙醇溶液1份，與0.1%漠甲酚綠乙醇溶液5份臨用時混合。0.1%的甲基紅乙醇溶液：0.1g甲基紅指示劑溶于100mL60%乙醇中；0.1%的漠甲酚綠乙醇溶液：0.1g漠甲酚綠指示劑溶于100mL20%乙醇中四、 實驗步驟1.樣品消化稱取面粉1.00g（±0.001g）,用稱量紙卷好小心的送入干燥消化管底部，切勿粘在瓶口或瓶頸。向另一消化管中加入1ml蒸餾水做空白試驗。在每個消化管中加入0.2g硫酸銅和6g硫酸鉀，兩顆玻璃珠，稍搖勻后瓶口放一小漏斗，加入20mL濃硫酸，將消化管分別放入消化架各個孔內(nèi)，然后置于消化爐上，在通風(fēng)櫥中加熱消化，接通電源，在加熱初始階段注意防止樣品飛濺。消化爐溫度起先控制在200°C左右（待內(nèi)容物全部炭化，泡沫停止后）20min后可以再設(shè)定至450C以上。消化終點是以消化液的顏色來判定的，當(dāng)消化液呈淺藍綠色的透明狀時，再繼續(xù)加熱沸騰10min，然后結(jié)束消化過程。取下放冷，小心加20mL水（注意慢加，邊加邊搖），放冷后，無損地轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混勻備用，即為消化液。堿化蒸餾蒸餾器中，堿液及蒸餾水采用電磁泵加入，NaOH、曰20注入接口用橡膠管套入后分別置入自備的容器中，加液時按面板上相應(yīng)開關(guān)，液體由泵吸入消化管內(nèi)。按面板上硼酸開關(guān)，量取硼酸試劑20mL于三角瓶中，加入混合指示劑2?3滴，準確吸取10.0mL樣品消化液，由小漏斗流入消化管，并以10mL蒸餾水洗滌進樣口流入反應(yīng)室，棒狀玻塞塞緊。再按面板上堿液開關(guān)，使10mL30%氫氧化鈉溶液倒入消化管，然后按面板上蒸餾開關(guān)，就開始蒸餾。從指示劑開始變色時計時，通入蒸汽蒸騰10min后，移動接收瓶，液面離開凝管下端，再蒸餾2min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部，取下三角瓶，準備滴定。同時吸取10.0mL試劑空白消化液按上法蒸餾操作。樣品滴定以0.01mol/L鹽酸標準溶液滴定由綠變?yōu)榈仙蚧疑?，即為終點。五、結(jié)果計算X=（匕-匕）*。x0.0140x「x100m x10式中 X—00樣品蛋白質(zhì)含量（g/100g）；V1——樣品滴定消耗鹽酸標準溶液體積（mL）；V2——空白滴定消耗鹽酸標準溶液體積（mL）；c——鹽酸標準滴定溶液濃度（mol/L）；0.0140——1.0mL鹽酸［c（HCl）=1.000mol/L］標準滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量（g）；m 樣品的質(zhì)量（g）；F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，一般食物為6.25；乳制品為6.38；面粉為5.70；高梁為6.24；花生為5.46；米為5.95；大豆及其制品為5.71；肉與肉制品為6.25；大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83；芝麻、向日葵5.30。計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。六、注意事項及說明（1）樣品應(yīng)是均勻的。固體樣品應(yīng)預(yù)先研細混勻，液體樣品應(yīng)振搖或攪拌均勻。（2） 樣品放入定氮瓶內(nèi)時，不要沾附頸上。萬一沾附可用少量水沖下，以免被檢樣消化不完全，結(jié)果偏低。（3）硝化時如不容易呈透明溶液，可將定氮瓶放冷后，慢慢加入 30%過氧化氫（H2O2）2-3ml，促使氧化。（4） 在整個消化過程中，不要用強火。保持和緩的沸騰，使火力集中在凱氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白質(zhì)在無硫酸存在的情況下，使氮有損失。（5） 如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會引起氨的損失，這樣會形成硫酸氫鉀，而不與氨作用。因此，當(dāng)硫酸過多的被消耗或樣品中脂肪含量過高時，要增加硫酸的量。（6） 加入硫酸鉀的作用為增加溶液的沸點，硫酸銅為催化劑，硫酸銅在蒸餾時作堿性反應(yīng)的指示劑。（7） 混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。如果沒有漠甲酚綠，可單獨使用0.1%甲基紅乙醇溶液。（8） 氨是否完全蒸餾出來，可用pH試紙試餾出液是否為堿性。（9）吸收液也可以用0.01當(dāng)量的酸代表硼酸，過剩的酸液用0.01N堿液滴定，計算時，A為試劑空白消耗堿液數(shù)，B為樣品消耗堿液數(shù)，N為堿液濃度，其余均相同。（10） 以硼酸為氨的吸收液，可省去標定堿液的操作，且硼酸的體積要求并不嚴格，亦可免去用移液管，操作比較簡便。（11） 向蒸餾瓶中加入濃堿時，往往出現(xiàn)褐色沉淀物，這是由于分解促進堿與