生物傳感檢測原理類型

生物傳感檢測原理類型第一頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日2.1生物傳感器定義、結(jié)構(gòu)生物傳感器定義生物傳感器(biosensor)是用生物活性材料(酶、蛋白質(zhì)、DNA、抗體、抗原、生物膜等)與物理換能器有機結(jié)合的器械或裝置，是發(fā)展生物技術(shù)必不可少的一種先進的檢測方法與監(jiān)控方法，也是物質(zhì)分子水平的快速、微量分析方法。第二頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日生物傳感器的結(jié)構(gòu)(組成)

根據(jù)定義，包括兩部分：

1、生物活性材料(也叫生物敏感膜、分子識別元件)。

2、物理換能器(也叫傳感器)第三頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日2.1生物傳感器定義、結(jié)構(gòu)

表2-1生物傳感器的生物敏感膜（分子識別元件）生物敏感膜

生物活性材料生物敏感膜生物活性材料酶各種酶類全細胞細菌、真菌、動植物細胞免疫物質(zhì)抗體、抗原、酶標(biāo)抗原細胞器線粒體、葉綠體DNA寡聚核苷酸組織動植物組織切片具有親和能力的物質(zhì)配體、受體模擬酶高分子聚合物生物敏感膜(biosensitivemembrane)

又稱為分子識別元件(molecularrecognitionelement)是生物傳感器的關(guān)鍵元件(表2-1)，直接決定傳感器的功能與質(zhì)量。依生物敏感膜所選用材料不同，其組成可以是酶、DNA、免疫物質(zhì)、全細胞、組織、細胞器或它們的組合，近年還引入了高分子聚合物模擬酶，使分子識別元件的概念進一步延伸。第四頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日2.1生物傳感器定義、結(jié)構(gòu)生物學(xué)反應(yīng)信息換能器選擇生物學(xué)反應(yīng)信息換能器選擇離子變化離子選擇性電極光學(xué)變化光纖、光敏管電阻、電導(dǎo)變化阻抗計、電導(dǎo)儀顏色變化光纖、光敏管質(zhì)子變化場效應(yīng)晶體管質(zhì)量變化壓電晶體等氣體分壓變化氣敏電極力變化微懸臂梁熱焓變化熱敏電阻、熱電偶振動頻率變化表面等離子共振換能器(transducer)

又稱為傳感器(sensor),其作用是將各種生物的、化學(xué)的和物理的信息轉(zhuǎn)變成電信號。生物反應(yīng)過程產(chǎn)生的信息是多元化的，微電子和傳感技術(shù)的現(xiàn)代成果為檢測這些信息提供了豐富的手段，使得研究者在設(shè)計生物傳感器時對換能器的選擇有足夠的回旋余地。設(shè)計的成功與否主要取決于設(shè)計方案的科學(xué)性和經(jīng)濟性，可供制作生物傳感器的基本換能器如下表(2-2)表2-2生物學(xué)反應(yīng)信息和換能器的選擇第五頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日2.2

生物傳感器的原理

待測物質(zhì)經(jīng)擴散作用進入生物活性材料，經(jīng)分子識別，發(fā)生生物學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生的信息繼而被相應(yīng)的物理或化學(xué)換能器轉(zhuǎn)變成可定量和可處理的電信號，再經(jīng)二次儀表放大并輸出，便可知道待測物濃度。圖示生物傳感器原理：

電信號待檢測物生物敏感膜物理變化此界面發(fā)生生物學(xué)反應(yīng)(分子識別過程)此界面發(fā)生能量轉(zhuǎn)換(轉(zhuǎn)換成電信號)此處發(fā)生信號轉(zhuǎn)換(模擬信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號)換能器計算機第六頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日2.3

生物傳感器的分類

生物傳感器的類型和命名方法比較多而且不盡統(tǒng)一，主要有兩種分類法。

按分子識別元件分類和按換能器類型分類。分子識別元件分類法分子印記生物傳感器微生物生物傳感器DNA生物傳感器細胞生物傳感器組織生物傳感器免疫生物傳感器酶生物傳感器換能器分類法懸臂梁生物傳感器阻抗/電導(dǎo)生物傳感器聲波生物傳感器電化學(xué)生物傳感器半導(dǎo)體生物傳感器熱生物傳感器光生物傳感器第七頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日2.4

生物傳感器的優(yōu)點(1)可重復(fù)使用采用固定化生物活性物質(zhì)作催化劑，價格昂貴的試劑可以重復(fù)多次使用，克服了過去酶法分析試劑費用高和化學(xué)分析繁瑣復(fù)雜的缺點。

(2)專一性強(選擇性高、特異性強)

如：酶只對特定的底物起反應(yīng)，而且不受顏色、濁度的影響。

(3)分析速度快可以在幾分鐘得到結(jié)果。

(4)準(zhǔn)確度高一般相對誤差可以達到1％

(5)操作系統(tǒng)比較簡單，容易實現(xiàn)自動分析

(6)成本低在連續(xù)使用時，每例測定僅需要幾分錢人民幣。第八頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日閱讀材料

中國生物傳感器技術(shù)發(fā)展的過程、現(xiàn)狀

中國生物傳感器研究始于20世紀(jì)八十年代初，從事生物傳感器研究的科研機構(gòu)有中國科學(xué)院微生物所、中國科學(xué)院上海生化所、清華大學(xué)、中國科學(xué)院武漢病毒所、中國科學(xué)院長春應(yīng)化所和湖南大學(xué)等單位。直至今日，這些單位仍在生物傳感器領(lǐng)域進行著創(chuàng)新研究和開發(fā)。最早展開生物傳感器的研討活動是1986年由中國微生物協(xié)會酶工程專業(yè)技術(shù)委員會組織的第一屆工業(yè)生化及酶工程全國學(xué)術(shù)會議。中國酶工程專業(yè)技術(shù)委員對這一領(lǐng)域的國內(nèi)外學(xué)術(shù)交流起到很好的作用，其活動包括定期召開的全國性酶工程學(xué)術(shù)會議和每隔二年一次的中日酶工程學(xué)術(shù)會議，其中生物傳感器都是重要的研討議題。

第九頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日我國生物傳感器領(lǐng)域的主要研究機構(gòu)研究機構(gòu)主要研究方向中國科學(xué)院微生物所臨床診斷分析用生物傳感器中國科學(xué)院武漢病毒所生物傳感器和生物芯片、分析用酶的分子工程，BOD微生物傳感器，手掌型血糖分析儀研制清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物芯片（DNA、蛋白質(zhì)芯片）中國科學(xué)院上海生化所生物傳感器技術(shù)的最新發(fā)展中國科學(xué)院電子學(xué)研究所傳感技術(shù)國家重點實驗室氫離子敏場效應(yīng)管，仿生生物傳感器，小型臺式SPR測試儀,微全分析系統(tǒng)中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)所免疫傳感器、生物芯片復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系電化學(xué)的酶、組織、微生物傳感器湖南大學(xué)化學(xué)計量與生物傳感國家重點實驗室組織、免疫傳感器陜西師范大學(xué)化學(xué)系光生物傳感器浙江大學(xué)教育部生物傳感器國家專業(yè)實驗室嗅覺和味覺生化傳感器南開大學(xué)教育部生物活性材料重點實驗室體內(nèi)藥物傳感器的開發(fā)研究第十頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日

20世紀(jì)九十年代至今我國生物傳感器研究隊伍逐漸擴大，其標(biāo)志之一是近10年來在中國國內(nèi)期刊上發(fā)表的以生物傳感器為關(guān)鍵詞的論文總數(shù)達到650篇，其中2003年的論文數(shù)量比1994年增加了約一倍。近十年的該領(lǐng)域?qū)＜业难芯勘尘耙矎纳飳W(xué)擴大到化學(xué)和電子學(xué)。表明了生物傳感器領(lǐng)域?qū)W科相互交叉的趨勢。近十年來在中國期刊發(fā)表的生物傳感器論文

年份1994199519961997199819992000200120022003論文數(shù)量486436475156676611890第十一頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日本章思考題生物傳感器的結(jié)構(gòu)組成生物傳感器的優(yōu)點第十二頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日第3章生物傳感檢測的生物學(xué)理論

——分子識別及生物反應(yīng)基礎(chǔ)本章主要內(nèi)容酶及酶反應(yīng)微生物反應(yīng)免疫反應(yīng)核酸及核酸反應(yīng)生物學(xué)反應(yīng)中的物理量變化第十三頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日概述生物傳感器的分子識別元件又叫敏感元件，主要指來源于生物體的生物活性物質(zhì)，包括酶、抗原、抗體和各種功能蛋白質(zhì)、核酸、微生物細胞、細胞器、動植物組織等。當(dāng)它們用做生物傳感器的敏感元件時，都無一例外地具有對靶分子(待檢測對象)特異的識別功能。分子識別常常是生物體進行各種簡單反應(yīng)或復(fù)雜反應(yīng)的前奏。生物反應(yīng)包括了生理生化、遺傳變異和新陳代謝等一切形式的生命活動，生物傳感器研究者的任務(wù)就是將生物反應(yīng)與傳感器技術(shù)有機結(jié)合起來。本章介紹4類生物反應(yīng)：酶反應(yīng)、微生物反應(yīng)、免疫反應(yīng)和核酸反應(yīng)，以及生物反應(yīng)中伴隨著發(fā)生的物理量變化。第十四頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.1

酶及酶反應(yīng)

1酶反應(yīng)基本概念

1）酶的定義人們對酶的認識在19世紀(jì)產(chǎn)生了飛躍，1854～1864年，Pasteur證明發(fā)酵作用是由微生物引起的，推翻了“自生論”。當(dāng)時曾提出“活體酵素”和“非活體酵素”的名詞。

1877年，Kuhne提出使用“enzyme”這個詞，將酶與微生物兩者區(qū)別開。Liebig等認為發(fā)酵不一定要和酵母細胞相聯(lián)系，而是由酵母細胞中所分泌的某些化學(xué)物質(zhì)(酶)所引起的。這一假設(shè)于1897年被Buchner兄弟證實，他們用酵母細胞濾液成功地進行了糖至乙醇和二氧化碳的轉(zhuǎn)化，一般認為，這項實驗是酶學(xué)研究的開始。此后近1個世紀(jì)中，酶學(xué)研究獲得一系列重要突破。此后，酶的蛋白質(zhì)屬性和催化功能被普遍認識。第十五頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日第十六頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.1酶及酶反應(yīng)2）酶的蛋白質(zhì)性質(zhì)酶是蛋白質(zhì)，這一結(jié)論最早由sumner提出，他在1926年首次從刀豆中提取了脲酶結(jié)晶，并證明這個結(jié)晶具有蛋白質(zhì)的一切性質(zhì)。以后人們又陸續(xù)獲得了多種結(jié)晶酶，在已經(jīng)鑒定的2000余種酶中，多數(shù)已被結(jié)晶或純化，檢索SIGMA目錄，作為商品出售的酶已經(jīng)達400多種。證明酶是蛋白質(zhì)有4點依據(jù)：①蛋白質(zhì)是氨基酸組成的，而酶的水解產(chǎn)物都是氨基酸，即酶是由氨基酸組成的。②酶具有蛋白質(zhì)所具有的顏色反應(yīng)，如雙縮脲反應(yīng)、茚三酮反應(yīng)、乙醛酸反應(yīng)等。③一切能使蛋白質(zhì)變性的因素，如熱、酸、堿、紫外線等，同樣可以使酶變性失活。④酶同樣具有蛋白質(zhì)所具有的大分子性質(zhì)，如不能透過半透膜，可以電泳，并有一定等電點。第十七頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.1

酶及酶反應(yīng)

3）酶的催化性質(zhì)

酶是生物催化劑。新陳代謝是由無數(shù)復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)組成的，這些反應(yīng)大都在酶催化的條件下進行。與一般催化劑相比較，酶催化具有如下特點。①高度專一性(specification)，或稱特異性。一般地講，一種酶只催化一種反應(yīng)，作用于特定的底物或化學(xué)鍵。因而有“一種酶，一種(類)底物”之說。②催化效率高。酶分子的轉(zhuǎn)化數(shù)(turnovernumber)為每個酶分子每分鐘大約轉(zhuǎn)化103個底物分子(不同的酶轉(zhuǎn)化數(shù)不一樣)。檢測底物濃度下限一般為10-9～10-6mol/L。以分子比為基礎(chǔ)，其催化效率是其他催化劑的107～1013倍。第十八頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日③酶催化一般在溫和條件下進行由于酶是蛋白質(zhì)，極端的環(huán)境條件(如高溫、酸堿)容易使酶失活。④有些酶(如脫氫酶)需要輔酶或輔基若從酶蛋白分子中除去輔助成分，則酶不表現(xiàn)催化活性。⑤酶在體內(nèi)的活力常常受多種方式調(diào)控包括基因水平調(diào)控、反饋調(diào)節(jié)、激素控制、酶原激活等。⑥酶促反應(yīng)產(chǎn)生的信息變化有多種形式，如熱、光、電、離子化學(xué)等。第十九頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.1酶及酶反應(yīng)4）

酶的分類與命名

按照酶的催化反應(yīng)類型，將酶分為六大類。

(1)氧化還原酶類(oxidoreductases)

催化氧化還原反應(yīng)，其代表方程式為：式中，A.2H為氫的給體；B為氫的受體。這類酶包括氧化酶、過氧化物酶、脫氫酶等。

(2)轉(zhuǎn)移酶類(transferases)

催化某一化學(xué)基團從某一分子到另一分子，其代表方程為：式中，B為被轉(zhuǎn)移的基團，如磷酸基、氨基、酰胺基等。這類酶包括轉(zhuǎn)氨酶、轉(zhuǎn)甲基酶等。第二十頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.1酶及酶反應(yīng)(3)水解酶類(hydrolases)

催化各種水解反應(yīng)，在底物特定的鍵上引入水的羥基和氫，一般反應(yīng)式為：包括肽酶(即蛋白酶，水解肽鍵)、酯酶(水解酯鍵)、糖苷酶(水解糖苷鍵)等。

(4)裂合酶類(lyases)

催化C-C、C-O、C-N或C=S鍵裂解或縮合，其代表反應(yīng)式為：如脫羧酶、碳酸酐酶等。第二十一頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日(5)異構(gòu)酶類(isomerases)

催化異構(gòu)化反應(yīng)，使底物分子內(nèi)發(fā)生重排，一般反應(yīng)式為：

這類酶包括消旋酶(如L-氨基酸轉(zhuǎn)變成D-氨基酸)、變位酶(如葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?l-磷酸)等。

(6)合成酶類(1igases)

或稱連接酶類，它催化兩個分子的連接并與腺苷三磷酸(ATP)的裂解偶聯(lián)，同時產(chǎn)生腺苷單磷酸(AMP)和焦磷酸(PPi)：如氨基酸激活酶類。第二十二頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.1

酶及酶反應(yīng)

每一大類酶又可根據(jù)作用底物的性質(zhì)分為若干亞類和次亞類。酶的名稱由兩部分組成，開頭部分是底物，后面部分表示催化反應(yīng)類型，再用-ase結(jié)尾。如催化丙酮酸羥基化生成草酰乙酸反應(yīng)的酶稱為丙酮酸羧化酶(pyruratecarboxylase)。也常常使用簡化或習(xí)慣名稱，如淀粉葡萄糖苷酶稱為糖化酶。酶學(xué)編號(ECnumber)由4個數(shù)字構(gòu)成，如脂肪酶(甘油酯水解酶)的系列編號為“EC3.1.1.3.”，表示第三大酶類(水解酶)、第一亞類(水解發(fā)生在酯鍵)、第一亞亞類(羥基酯水解)、甘油酯水解酶。第二十三頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.1酶及酶反應(yīng)5）酶量表示法在用酶作分析工具時，酶量的表示有幾種方法，根據(jù)國際酶學(xué)委員會規(guī)定，分別定義如下。

酶活力單位用國際單位(InternationalUnit，IU)表示。一個酶活力單位指在特定條件下(如25℃，pH及底物等其他條件采用最佳條件)，在1min能轉(zhuǎn)化1μmol底物分子的酶量，單位為IU。

酶比活力(specificactivity)指1mg酶所具有的酶活力。一般用IU/mg表示。

酶含量指每克或每毫升酶制劑含有的活力單位數(shù)，即IU/g或IU/ml。第二十四頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.1

酶及酶反應(yīng)3.2

酶的作用機理

1）降低反應(yīng)活化能一個封閉的反應(yīng)體系中，反應(yīng)開始時，反應(yīng)底物分子的平均能量水平較低，為初態(tài)(initialstate，A)，只有少數(shù)分子具有比初態(tài)更高一些的能量，高出的這一部分能量稱為活化能G1-(energyofactivation)．使這些分子進入活化態(tài)(或過渡態(tài)transitionstate，A*)，才能進行反應(yīng)，這些活潑的分子稱為活化分子。反應(yīng)物中活化分子愈多，反應(yīng)速度就愈快?；罨艿亩x是：在一定溫度下，1mol底物全部進入活化態(tài)所需要的自由能F(freeenergy)，單位是J/mol。酶能夠大幅度降低反應(yīng)所需要的活化能，使活化能降到G2，這樣，大量的反應(yīng)物分子就比較容易地越過小的“能峰”，進入活化態(tài)(圖2-1)，從而使反應(yīng)在常溫下極快地進行。與一般催化劑相比，酶催化使活化能降低幅度更大。第二十五頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.1

酶及酶反應(yīng)2)結(jié)構(gòu)專一性酶催化的專一性是由酶蛋白分子(特別是分子中的活性部位)結(jié)構(gòu)特性決定的，根據(jù)酶對底物專一性程度的不同，大致可分為三種類型。第一種類型的酶專一性較低，能作用于結(jié)構(gòu)類似的一系列底物。第二種類型的酶僅對一種物質(zhì)有催化作用，它們對底物的化學(xué)鍵及其兩端均有絕對要求。第三種類型的酶具有立體專一性，這類酶不僅要求底物有一定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，而且要求有一定的立體結(jié)構(gòu)。第二十六頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.1

酶及酶反應(yīng)3）酶的輔助因子許多酶需要輔助因子(co-factor)才能行使催化功能。輔助因子包括金屬離子和有機化合物，它們構(gòu)成酶的輔酶(co-enzyme)或輔基(prostheticgroup)，與酶蛋白共同組成全酶(holoenzyme)。脫去輔基的酶蛋白不含有催化活性，稱為脫輔基酶蛋白(apoenzyrme)，有時又稱為酶原(proenzyme,zymogen)。輔酶與輔基沒有嚴(yán)格的區(qū)別，一般地，與酶蛋白松弛結(jié)合的輔助因子稱為輔酶，與酶蛋白牢固結(jié)合的輔助因子稱為輔基。輔助因子通常存在酶的活性中心部位，對酶的催化起重要作用。第二十七頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.1

酶及酶反應(yīng)

4)酶的活性中心酶的特殊催化能力只局限在它的大分子的一定區(qū)域，這個區(qū)域就是酶的活性中心，它往往位于分子表面的凹穴中。對不需要輔酶的酶來說，活性中心(activecenter)就是酶分子中在三維結(jié)構(gòu)上比較靠近的幾個氨基酸殘基組成。對需要輔酶的酶分子來說，輔酶分子，或輔酶分子上的某一部分結(jié)構(gòu)往往就是活性中心的組成部位?；钚灾行牡母骰鶊F與酶分子的其他殘基有序地排列，使得這個部位的空間結(jié)構(gòu)恰好適合與底物分子直接緊密接觸，并具有適宜的非極性微環(huán)境，以利于基團間發(fā)生靜電作用?；钚灾行挠袃蓚€功能部位(或域)；結(jié)合域(bindingdomain)和催化域(catalyticdomain)。這種特定的結(jié)構(gòu)才能與一定的底物結(jié)合，并催化其發(fā)生化學(xué)變化?；钚灾行目臻g結(jié)構(gòu)的任何細微的改變，都可能影響酶活性。第二十八頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.1

酶及酶反應(yīng)5)酶催化的化學(xué)形式酶催化的化學(xué)形式主要包括共價催化和酸堿催化。

共價催化中，酶與底物形成反應(yīng)活性很高的共價中間物，這個中間物很易變成過渡態(tài)(transitionstate)，故反應(yīng)的活化能大大降低，底物可以越過較低的能閾而形成產(chǎn)物。

酸堿催化廣義地指質(zhì)子供體及質(zhì)子受體的催化。酶反應(yīng)中的酸堿催化十分重要，發(fā)生在細胞內(nèi)的許多反應(yīng)都是受酸堿催化的，如將水加到羰基上、酯類的水解、各種分子重排以及許多取代反應(yīng)等。

酶蛋白中可以起酸堿催化作用的功能團有氨基、羧基、巰基、酚羥基及咪唑基等，其中組氨酸的咪唑基既是一個很強的親核基團，又是一個有效的廣義酸堿功能基。因此，咪唑基是酶的酸堿催化中最活潑的一個催化功能基。第二十九頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.2

微生物反應(yīng)

1微生物反應(yīng)特點微生物反應(yīng)過程是利用微生物進行生物化學(xué)反應(yīng)過程，即微生物反應(yīng)就是將微生物作為生物催化劑進行的反應(yīng)。酶在微生物反應(yīng)中起最基本的催化作用。

微生物反應(yīng)與酶促反應(yīng)的共同點：①同屬生化反應(yīng)，都在溫和條件下進行；②凡是酶能催化的反應(yīng)，微生物也可以催化；③催化速度接近，反應(yīng)動力學(xué)模式近似。第三十頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日

微生物反應(yīng)的特殊性：①微生物細胞的膜系統(tǒng)為酶反應(yīng)提供了天然的適宜環(huán)境，細胞可以在相當(dāng)長的時間內(nèi)保持一定的催化活性；②在多底物反應(yīng)時，微生物顯然比單純酶更適宜作催化劑；③細胞本身能提供酶促反應(yīng)所需的各種輔助因子和能量；④更重要的是，微生物細胞比酶的來源更方便、更廉價。第三十一頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日

利用微生物作傳感器分子識別元件的不利因素：①微生物反應(yīng)通常伴隨細胞的生長或凋亡，不容易建立分析標(biāo)準(zhǔn)；②細胞是多酶系統(tǒng)，許多代謝途徑并存，難以排除不必要的反應(yīng)；③環(huán)境條件變化會引起微生物生理狀態(tài)的復(fù)雜化，不適當(dāng)?shù)牟僮鲿?dǎo)致代謝轉(zhuǎn)換現(xiàn)象，出現(xiàn)不期望有的反應(yīng)。第三十二頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日

2分析微生物學(xué)分析微生物學(xué)(analyticalmicrobiology)是利用微生物完成定量分析任務(wù)的學(xué)科。在有些情況下，微生物測定法比化學(xué)方法更專一和靈敏，效率亦更高。有幾種測定的形式，如細胞的增殖，酸、堿類等代謝產(chǎn)物的生成，呼吸強度，細胞內(nèi)部亞系統(tǒng)的反應(yīng)(如鹽類從細胞中滲漏出來)以及物理性態(tài)的變化等，其中以細胞增殖和呼吸法最為常用。第三十三頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日

細胞增殖法的原理是，某些微生物必須依賴一些氨基酸、維生素、嘌呤和嘧啶等物質(zhì)生長，當(dāng)培養(yǎng)液中缺少某一種必需營養(yǎng)時，就限制菌體生長。因此，菌體增殖與必需營養(yǎng)物質(zhì)的濃度成正相關(guān)。另一方面，抗生素能抑制菌體生長，根據(jù)菌體增殖速度可以測定抗生素類的濃度。菌體增殖采用平板生長計數(shù)法和菌懸液渾濁度法，測定周期為1天至數(shù)天，靈敏度μg/ml級。第三十四頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日

呼吸法是根據(jù)菌體在同化底物或被抑制生長時的CO2釋放或O2的消耗進行測定，通常采用瓦勃測壓法，反應(yīng)時間為數(shù)十分鐘至數(shù)小時。如制霉菌素能降低酵母菌的CO2排出量，大腸桿菌能對谷氨酸脫羧并釋放足夠可檢的CO2等。在被分析底物能促進微生物代謝的情況下，關(guān)鍵是要獲得對底物的專一性反應(yīng)。實驗菌株常常是一些經(jīng)過變異的菌株，它們或成為對某些營養(yǎng)的依賴性稱為營養(yǎng)缺陷型，或能在體內(nèi)高濃度地積累某種酶，由此實現(xiàn)測定的專一性。第三十五頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.3免疫學(xué)反應(yīng)免疫指機體對病原生物感染的抵抗能力?？蓞^(qū)別為自然免疫和獲得性免疫。

自然免疫是非特異性的，即能抵抗多種病原微生物的損害，如完整的皮膚、黏膜、吞噬細胞、補體、溶菌酶、干擾素等。

獲得性免疫一般是特異性的，在微生物等抗原物質(zhì)刺激后才形成(免疫球蛋白等)，并能與該抗原起特異性反應(yīng)。上述各種免疫過程中，抗原與抗體的反應(yīng)是最基本的反應(yīng)。第三十六頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.3免疫學(xué)反應(yīng)1抗原

1）抗原的定義抗原(antigen)是能夠刺激動物機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的物質(zhì)，但從廣義的生物學(xué)觀點看，凡是具有引起免疫反應(yīng)性能的物質(zhì)，都可以稱為抗原。抗原有兩種性能：刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)；與相應(yīng)免疫反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。前一種性能稱為免疫原性(immunogenicity)，后一種性能稱為反應(yīng)原性(reactionogenicity)。具有免疫原性的抗原是完全抗原(completeantigen,Ag)，只有反應(yīng)原性，不刺激免疫應(yīng)答反應(yīng)的稱為半抗原(hapten)。第三十七頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.3免疫學(xué)反應(yīng)第三十八頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.3免疫學(xué)反應(yīng)3）抗原的理化性狀

(1)物理性狀完全抗原的分子質(zhì)量較大，通常在104D以上。分子質(zhì)量越大，其表面積相應(yīng)越大，接觸免疫系統(tǒng)細胞的機會增多，因而免疫原性也就增強。相對分子質(zhì)量低于5000～10000就無免疫原性，如半抗原雌酮-3-葡萄糖苷酸的相對分子質(zhì)量只有468。抗原均具有一定的分子構(gòu)型，或為直線或為立體構(gòu)型。一般認為環(huán)狀構(gòu)型比直線排列的分子免疫原性強，聚合態(tài)分子比單體分子的強。

(2)化學(xué)組成自然界中絕大多數(shù)抗原都是蛋白質(zhì)，既可為純蛋白質(zhì)，也可為結(jié)合蛋白質(zhì)，后者包括脂蛋白、核蛋白、糖蛋白等。此外還有血清蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、微生物蛋白及其多糖、脂多糖(細菌內(nèi)毒素)、植物蛋白和酶類。近年來證明核酸也有抗原性。第三十九頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.3免疫學(xué)反應(yīng)4）抗原決定簇抗原決定簇(antigendeterminant)是抗原分子表面的特殊化學(xué)基團，抗原的特異性取決于抗原決定簇的性質(zhì)、數(shù)目和空間排列。不同種系的動物血清白蛋白因其末端氨基酸排列的不同，而表現(xiàn)出各自的種屬特異性(表2-2)。一種抗原常具有一個以上的抗原決定簇，如牛血清蛋白有14個，甲狀腺球蛋白有40個。第四十頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.3免疫學(xué)反應(yīng)2抗體抗體(antibody)是由抗原刺激機體產(chǎn)生的具有特異性免疫功能的球蛋白，又稱免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。人類免疫球蛋白有五類，即IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。免疫球蛋白都是由一個至幾個單體組成。每一個單體有兩條相同的分子質(zhì)量較大的重鏈(heavychain,H鏈)和兩條相同分子質(zhì)量的較小的輕鏈(lightchain，L鏈)組成，鏈與鏈之間通過二硫鏈(-S-S-)及非共價鏈相連接(圖2-6)。CH1CH2CH3VHVLCL第四十一頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.3免疫學(xué)反應(yīng)

每條重鏈的分子質(zhì)量為55000D，由420～460個氨基酸組成。各種Ig重鏈的氨基酸組成不同，因而抗原性亦各異，可分為α、γ、δ、μ及ε，分別構(gòu)成IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。一條重鏈可分為四個功能區(qū)，每一功能區(qū)約含110個氨基酸，N端的功能區(qū)是重鏈的可變區(qū)(VH)，其余為重鏈的恒定區(qū)(CH)，分別稱為CH1、CH2和CH3。輕鏈分子質(zhì)量為22000D，由213～216個氨基酸組成。每條輕鏈分為兩個功能區(qū)，N端為輕鏈可變區(qū)(VL)，約含109個氨基酸．余下部分為恒定區(qū)(CL)。輕鏈有兩種類型，每一種Ig只能含一種類型的輕鏈，即或為H型，或為λ型。在VL區(qū)和VH區(qū)都發(fā)現(xiàn)了更易變化的區(qū)域，稱其為高變區(qū)。高變區(qū)是抗體結(jié)合抗原的高度特異性所在，而變化區(qū)其他部分主要功能是為高變區(qū)提供合適的三維空間結(jié)構(gòu)，以使抗原分子有一合適的淺槽。CH1CH2CH3VHVLCL第四十二頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.3免疫學(xué)反應(yīng)3抗原-抗體反應(yīng)抗原-抗體結(jié)合時將發(fā)生凝聚、沉淀、溶解反應(yīng)和促進吞噬抗原顆粒的作用。

抗體與抗原的特異性結(jié)合點位于FabL鏈及H鏈的高變區(qū)，又稱抗體活性中心，其構(gòu)型取決于抗原決定簇的空間位置，兩者可形成互補性構(gòu)型。在溶液中，抗原和抗體兩個分子的表面電荷與介質(zhì)中離子形成雙層離子云，內(nèi)層和外層之間的電荷密度差形成靜電位和分子間引力。由于這種引力僅在近距離上發(fā)生作用，抗原與抗體分子結(jié)合時對位應(yīng)十分準(zhǔn)確。第四十三頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日

這種準(zhǔn)確對位是由于兩個條件所致，一是結(jié)合部位的形狀要互補于抗原的形狀；二是抗體活性中心帶有與抗原決定簇相反的電荷。然而，抗體的特異性是相對的，表現(xiàn)在兩個方面：其一，部分抗體不完全與抗原決定簇相對應(yīng)。如雞白蛋白的抗體可與其他鳥類白蛋白發(fā)生反應(yīng)，這種現(xiàn)象稱為交叉反應(yīng)(crossreaction)，交叉反應(yīng)與同源性抗原反應(yīng)有顯著差異；其二，即便是針對某一種半抗原的抗體，其化學(xué)結(jié)構(gòu)也可能不一致。第四十四頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日

抗原與抗體結(jié)合盡管是穩(wěn)固的，但也可能是可逆的。調(diào)節(jié)溶液的pH或離子強度，可以促進可逆反應(yīng)。某些酶能促使逆反應(yīng)，抗原-抗體復(fù)合物解離時，都保持自己本來的特性。例如，用生理鹽水把毒素-抗毒素的中性混合物稀釋至原濃度的l％時，所得到的液體仍有毒性，說明復(fù)合物發(fā)生解離，該復(fù)合物能在體內(nèi)解離而導(dǎo)致中毒。第四十五頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.3免疫學(xué)反應(yīng)4免疫學(xué)分析

1）沉淀法可溶性抗體與其相應(yīng)的抗原在液相中相互接觸，可形成不溶性抗原-抗體復(fù)合物而發(fā)生沉淀，包括擴散實驗和電泳試驗，此為經(jīng)典的免疫學(xué)實驗，靈敏度水平為pg/ml級。

2）放射免疫測定法(radiationimmunoassay,RIA)

利用放射性同位素示蹤技術(shù)和免疫化學(xué)技術(shù)結(jié)合起來的方法，具有靈敏度高、特異性強、準(zhǔn)確度佳、重復(fù)性好等特點，可檢出10-12～10-9g痕量物質(zhì)。經(jīng)典的RIA用已知濃度的標(biāo)記(14C，32P，35S，3H等)抗原和樣品抗原競爭限量的抗體，曾經(jīng)廣泛應(yīng)用，缺點是要使用同位素，對操作者和環(huán)境有一定的危害性。第四十六頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3）免疫熒光測定法將抗體(或抗原)標(biāo)記上熒光素與相應(yīng)的抗原(或抗體)結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)特異性熒光，稱為免疫熒光法(immunofluorescentassay)。最常用的熒光染料為異硫氰酸熒光素(FITC)。FITC有兩種異構(gòu)體，都能與蛋白良好地結(jié)合，其最大吸收光譜為490～495nm，最大發(fā)射光譜為520～530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。免疫熒光法不僅具有高度的特異性和敏感性，而且能對組織或細胞樣品中的微量抗原或微量抗體進行定位，具有形態(tài)學(xué)特征。第四十七頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.3免疫學(xué)反應(yīng)4）

酶聯(lián)免疫測定法(enzymelinkedimmunoassay,ELISA)

用酶促反應(yīng)的放大作用來顯示初級免疫學(xué)反應(yīng)。為此，需要制備酶標(biāo)抗體或酶標(biāo)抗原，通稱酶結(jié)合物(enzymeconjugate)。該結(jié)合物保留原先的免疫學(xué)活性和酶學(xué)活性。實驗時，首先是抗原-抗體之間的特異性結(jié)合，然后加入酶的相應(yīng)底物，在酶的催化下發(fā)生水解、氧化或其他反應(yīng)，生成有色產(chǎn)物。酶結(jié)合物發(fā)揮酶的催化作用，其活性與產(chǎn)物呈現(xiàn)的色度成正比，并反映被測抗原或被測抗體的量。當(dāng)采用競爭結(jié)合(如酶標(biāo)抗原與樣品中抗原同時競爭有限的抗體)時，色度與樣品抗原濃度成反比。

ELISA方法中需用固相載體作為免疫吸附劑，以便將結(jié)合酶標(biāo)記物的與游離的酶標(biāo)記物分離，故又稱酶標(biāo)固相免疫測定法。

ELISA雖然靈敏度不如放射性免疫法和免疫熒光，但特異性、重視性和準(zhǔn)確性很好，同時具有試驗成本低、試劑穩(wěn)定性好和操作安全等特點，故是目前應(yīng)用最廣的免疫學(xué)檢測方法。第四十八頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.4核酸與核酸反應(yīng)1核酸組成與結(jié)構(gòu)核酸是所有生命體的遺傳信息分子，包括脫氧核糖核酸(DNA,deoxyribonucleicacid)和核糖核酸(RNA,ribonucleicacid)。兩類核酸都是由單核苷酸(nucleotide)組成的多聚物。核酸分子中的核苷序列組成密碼，其功能是貯存和傳輸遺傳信息，指導(dǎo)各種類型蛋白質(zhì)的合成。單核苷酸的組成包括以下三個部分。①嘧啶(pyrimidine)和嘌呤(purine)，均含有氮堿基，通常簡稱為堿基(base)。嘧啶含有一個環(huán)，共有三種，尿嘧啶(U)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)；嘌呤含有兩個環(huán)，共有兩種，腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)。②五碳糖(脫氧核糖和核糖)。③1～3個磷酸基團。第四十九頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日

其中，氮堿基與核糖或脫氧核糖的l位碳相連。兩個五碳糖只是在第2個碳上有區(qū)別—羥基或脫氧。該結(jié)構(gòu)稱為核苷(nucleoside)。核苷上五碳糖的5位碳與磷酸相連，形成單磷酸核苷酸、二磷酸核苷酸或三磷酸核苷酸。兩種核酸分子的組成見圖2-7。核苷之間通過磷酸彼此連接成聚合物，為骨架鏈。其中，DNA鏈含有脫氧核糖和A、T、C、G4種堿基，RNA含有核糖和A、U、C、G4種堿基。T與U的惟一區(qū)別是T的環(huán)中含有甲基，而U沒有。完整的核酸分子中通常含有一些被化學(xué)修飾過的堿基。第五十頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.4核酸與核酸反應(yīng)第五十一頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期日3.4核酸與核酸反應(yīng)

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核酸