細胞衰老與凋亡

二、Hayflick界限(HayflickLimitation）

概念：

關(guān)于細胞增殖能力和壽命是有限的觀點。細胞，至少是培養(yǎng)的二倍體細胞，不是不死的，而是有一定的壽命；它們的增殖能力不是無限的，而是有一定的界限，這就是Hayflick界限。癌細胞或培養(yǎng)的細胞系是不正常細胞，其染色體數(shù)目或形態(tài)已經(jīng)不同于原先的細胞細胞的增殖能力與供體年齡有關(guān)物種壽命與培養(yǎng)細胞壽命之間存在著一定的關(guān)系二倍體細胞的衰老是由細胞本身決定的 ◆決定細胞衰老的因素在細胞內(nèi)部，而不是外部的環(huán)境 ◆是細胞核而不是細胞質(zhì)決定了細胞衰老1當前第1頁\共有25頁\編于星期四\21點細胞來源人胚肺成纖維細胞中年人成纖維細胞老年人成纖維細胞可增殖代數(shù)40-60202-4不同年齡來源的人成纖維細胞的增殖代數(shù)2當前第2頁\共有25頁\編于星期四\21點三、細胞在體內(nèi)條件下的衰老●在機體內(nèi)，細胞的衰老和死亡是常見的現(xiàn)象，甚至在個體發(fā)育的早期也會發(fā)生;●正常情況下終生保持分裂的細胞，其分裂能力是否隨著有機體年齡的增高而下降？它們會不會衰老？

◆衰老動物體內(nèi)，細胞分裂速度顯著減慢，其原因主要是G1期明顯延長;◆衰老個體內(nèi)的環(huán)境因素影響了細胞的增殖和衰老; ◆骨髓干細胞移植實驗說明隨著年齡的增加，干細胞增殖速度也趨緩慢.3當前第3頁\共有25頁\編于星期四\21點四、衰老細胞結(jié)構(gòu)的變化細胞核的變化：體外培養(yǎng)的二倍體細胞，細胞核隨著細胞分裂次數(shù)的增加不斷增大；細胞核的核膜內(nèi)折（invagination）、染色質(zhì)固縮化；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化：衰老動物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成分彌散性地分散于核周胞質(zhì)中，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的總量似乎是減少了；線粒體的變化：通常細胞中線粒體的數(shù)量隨齡減少，而其體積則隨齡增大；致密體的生成：脂褐質(zhì)，老年色素等膜系統(tǒng)的變化：衰老的細胞，其膜流動性降低、韌性減小。衰老細胞間間隙連接減少；細胞膜內(nèi)（P面）顆粒的分布也發(fā)生變化（減少）。

4當前第4頁\共有25頁\編于星期四\21點五、細胞衰老的分子機理●氧化性損傷學說：代謝過程中產(chǎn)生的活性氧基團或分子（ROS---O2-，OH-，H2O2），引發(fā)的氧化性損傷的積累，最終導致衰老。●端粒與衰老：發(fā)現(xiàn)端粒長度確實與衰老有著密切的關(guān)系，提出細胞衰老的“有絲分裂鐘”學說（Harley,1990）●rDNA與衰老:酵母染色體外rDNA環(huán)（ERC）的積累，導致細胞衰老?！癯聊畔⒄{(diào)節(jié)蛋白復合物（Sircomplex）與衰老：Sircomplex存在于異染色質(zhì)區(qū)，其作用在于阻斷所在位點DNA轉(zhuǎn)錄。●SGS1基因和WRN基因與衰老：SGS1基因和WRN基因同源,編碼解旋酶;酵母sgs1突變體壽命明顯短于野生型（平均9.5代:24.5代）;wrn突變引發(fā)早老癥.●發(fā)育程序與衰老:●線粒體DNA與衰老:Sen-DNA(80年代);mtDNA突變積累與細胞衰老有關(guān). 5當前第5頁\共有25頁\編于星期四\21點第二節(jié)細胞凋亡(Apoptosis)●細胞凋亡的概念及其生物學意義●細胞凋亡的形態(tài)學和生物化學特征●細胞凋亡的分子調(diào)控機理6當前第6頁\共有25頁\編于星期四\21點一、細胞凋亡的概念及其生物學意義●概念：細胞凋亡是一個主動的由基因決定的自動結(jié)束生命的過程，所以也常常被稱為細胞編程死亡（programmedcelldeath,PCD）。凋亡細胞將被吞噬細胞吞噬?！裆飳W意義：細胞凋亡對于多細胞生物個體發(fā)育的正常進行，自穩(wěn)平衡的保持以及抵御外界各種因素的干擾方面都起著非常關(guān)鍵的作用：

蝌蚪尾的消失，骨髓和腸的細胞凋亡，

脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，

發(fā)育過程中手和足的成形過程。7當前第7頁\共有25頁\編于星期四\21點二、細胞凋亡的形態(tài)學和生物化學特征●細胞凋亡與壞死(necrosis)●細胞凋亡的形態(tài)學特征●細胞凋亡的生化特征●誘導細胞凋亡的因子●細胞凋亡的檢測8當前第8頁\共有25頁\編于星期四\21點細胞凋亡與壞死(necrosis)●二者的主要區(qū)別是：細胞凋亡過程中，細胞質(zhì)膜反折，包裹斷裂的染色質(zhì)片段或細胞器，然后逐漸分離，形成眾多的凋亡小體（apoptoticbodies），凋亡小體則為鄰近的細胞所吞噬。整個過程中，細胞質(zhì)膜的整合性保持良好，死亡細胞的內(nèi)容物不會逸散到胞外環(huán)境中去，因而不引發(fā)炎癥反應。相反，在細胞壞死時，細胞質(zhì)膜發(fā)生滲漏，細胞內(nèi)容物，包括膨大和破碎的細胞器以及染色質(zhì)片段，釋放到胞外，導致炎癥反應。9當前第9頁\共有25頁\編于星期四\21點細胞凋亡的形態(tài)學特征◆凋亡的起始：細胞表面的特化結(jié)構(gòu)如微絨毛消失，細胞間接觸的消失，但細胞膜依然完整；線粒體大體完整，但核糖體逐漸從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔膨脹，并逐漸與質(zhì)膜融合；染色質(zhì)固縮，形成新月形帽狀結(jié)構(gòu)等形態(tài)，沿著核膜分布◆凋亡小體的形成：核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些細胞器如線粒體一起聚集，為反折的細胞質(zhì)膜所包圍。細胞表面產(chǎn)生了許多泡狀或芽狀突起，逐漸形成單個的凋亡小體◆凋亡小體逐漸為鄰近的細胞吞噬并消化10當前第10頁\共有25頁\編于星期四\21點細胞凋亡的生化特征◆細胞凋亡的主要特征是形成大小為180～200bp特征性的DNAladders◆凋亡細胞組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶tTG（tissueTransglutaminase）積累并達到較高水平11當前第11頁\共有25頁\編于星期四\21點誘導細胞凋亡的因子◆物理性因子，包括射線（紫外線，射線等），較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等。◆化學及生物因子：包括活性氧基團和分子，DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑，激素，細胞生長因子，腫瘤壞死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗體等12當前第12頁\共有25頁\編于星期四\21點細胞凋亡的檢測形態(tài)學觀測：染色法、透射和掃描電鏡觀察DNA電泳：DNA片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶TUNEL測定法，即DNA斷裂的原位末端標記法細胞凋亡中,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。彗星電泳法（cometassay）流式細胞分析根據(jù)凋亡細胞DNA斷裂和丟失，采用碘化丙啶使DNA產(chǎn)生激發(fā)熒光，用流式細胞儀檢出凋亡的亞二倍體細胞，同時又能觀察細胞的周期狀態(tài)。13當前第13頁\共有25頁\編于星期四\21點三、細胞凋亡的分子調(diào)控機理對哺乳動物細胞凋亡的基因凋控過程目前還不十分清楚，研究表明與細胞增殖有關(guān)的原癌基因和抑癌基都參于對細胞凋亡的凋控。其中研究較多的有bcl-2c-myc、p53、Ice、Fas/APO-1等。線蟲(C.elegans)凋亡研究發(fā)現(xiàn)ced3,ced4基因促進細胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制細胞凋亡。Ced3哺乳類同源物是ICE(Interleukin-1-convertingenzyme)，即Caspase1Caspase家族與凋亡Bcl-2家族、線粒體與細胞凋亡p53與細胞凋亡是一種抑癌基因，其生物學功能是在G期監(jiān)視DNA的完整性。如有損傷，則抑制細胞增殖。直到DNA修復完成。14當前第14頁\共有25頁\編于星期四\21點Caspase家族與凋亡Caspase家族Caspase是近年來發(fā)現(xiàn)的一組存在與細胞質(zhì)中的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶，其活性位點是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位點是天冬氨酸殘基后的肽鍵，因此稱為Cysteineasparticacicspecificprotease，即CaspaseCaspase活化Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依賴于其他的Caspase在它的天冬氨酸位點裂解活化或自身活化胞外信號分子誘導的細胞凋亡途徑15當前第15頁\共有25頁\編于星期四\21點胞外信號分子誘導的細胞凋亡途徑

凋亡信號通路當細胞接受凋亡信號分子(Fas,TNF等)后，凋亡細胞表面信號分子受體相互聚集并與細胞內(nèi)的銜接蛋白(Adaptorprotein)結(jié)合，這些銜接蛋白又募集Procaspases聚集在受體部位，Procaspase相互活化并產(chǎn)生級聯(lián)反應，使細胞凋亡下游Caspases活化后，作用底物：裂解核纖層蛋白，導致細胞核形成凋亡小體；裂解DNase結(jié)合蛋白，使DNase釋放，降解DNA形成DNALadder裂解參與細胞連接或附著的骨架和其他蛋白，使凋亡細胞皺縮、脫落，便于細胞吞噬；導致膜脂PS重排，便于吞噬細胞識別并吞噬。16當前第16頁\共有25頁\編于星期四\21點Bcl-2家族、線粒體與細胞凋亡Bcl-2是一種原癌基因，是ced-9在哺乳類中的同源物，能抑制細胞凋亡；與線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相結(jié)合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的結(jié)構(gòu)域；Bcl-2家族成員的基因中，常常含有三個保守的Bcl-2同源區(qū)，即BH1，BH2和BH3Bcl-2、線粒體與細胞凋亡當Caspase8活化后，它一方面作用于Procaspase3，另一方面使Bid裂解成2個片段，其中含BH3結(jié)構(gòu)域的C-端片段被運送到線粒體，與Bcl-2/Bax的BH3結(jié)構(gòu)域形成復合物，導致細胞色素C釋放。CytC與胞質(zhì)中Ced4同源物Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子apoptosisproteaseactivatingfactor)結(jié)合并活化Apaf-1，活化的Apaf-1再活化Procaspase9，最后引起細胞凋亡。哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)的Apaf2即是CytC17當前第17頁\共有25頁\編于星期四\21點18當前第18頁\共有25頁\編于星期四\21點19當前第19頁\共有25頁\編于星期四\21點

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