蛋白質(zhì)高效液相色譜技術(shù)

高效液相色譜法在蛋白質(zhì)

分離中的應(yīng)用陳

檬S1030624張雙健S1030621郭傳龍S1030622石晨陽S1030623汪菊芬S1030625當(dāng)前第1頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)高效液相色譜技術(shù)特點(diǎn)概述1HPLC系統(tǒng)各組分介紹；2流動相的要求及準(zhǔn)備過程354HPLC色譜技術(shù)與其他技術(shù)聯(lián)用5HPLC應(yīng)用舉例6現(xiàn)狀與展望6當(dāng)前第2頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)

應(yīng)用范圍廣高靈敏度高效高壓分析速度快HPLC是近二十年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新穎快速的分離技術(shù)。它是在經(jīng)典液相層析法基礎(chǔ)上，引進(jìn)了氣相層析的理論具有氣相層析的全部優(yōu)點(diǎn)。特點(diǎn)當(dāng)前第3頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)根據(jù)分離機(jī)理蛋白質(zhì)HPLC又可分為1243高效凝膠過濾色譜(HPSEC)高效離子交換色譜（HPIEC）高效親和色譜（HPAFC）反向高效液相色譜（RP-HPLC）當(dāng)前第4頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)高效液相色譜儀當(dāng)前第5頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)常用的HPLC儀Waters公司Agilent公司島津公司等當(dāng)前第6頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)一進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣方式隔膜進(jìn)樣*閥進(jìn)樣

自動進(jìn)樣

停流進(jìn)樣當(dāng)前第7頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)六通閥進(jìn)樣

高效液相色譜系統(tǒng)中最理想的進(jìn)樣器，它是由圓形密封墊(轉(zhuǎn)子)和固定底座(定子)組成。美國Rheodyne公司的六通閥進(jìn)樣器最為通用，各大HPLC儀器制造商均以此產(chǎn)品作為儀器的進(jìn)樣器。

上樣分析當(dāng)前第8頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)開始分析廢液樣品

淋洗液至分離柱進(jìn)樣閥樣品裝樣廢液

淋洗液至分離柱定量環(huán)進(jìn)樣（ＬＯＡＤ）（ＩＮＪＥＣＴ）樣品環(huán)當(dāng)前第9頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)進(jìn)樣方式部分裝液法

進(jìn)樣量應(yīng)不大于定量環(huán)體積的50%（最多75％），并要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同。缺點(diǎn)是易產(chǎn)生由進(jìn)樣引起的峰展寬

完全裝液法

進(jìn)樣量應(yīng)不小于定量環(huán)體積的5~10倍（最少3倍），這樣才能完全置換定量環(huán)內(nèi)的流動相，消除管壁效應(yīng)，確保進(jìn)樣的準(zhǔn)確度及重復(fù)性當(dāng)前第10頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)二輸液系統(tǒng)在線脫氣裝置梯度儀高壓輸液泵輸液系統(tǒng)當(dāng)前第11頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)高壓輸液泵

輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。其作用是將流動相以穩(wěn)定的流速或壓力輸入到色譜系統(tǒng)。泵的性能好壞直接影響到整個系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性。流量穩(wěn)定流量范圍寬輸出壓力高液缸容積小密封性能好，耐腐蝕

當(dāng)前第12頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)柱塞往復(fù)泵流量不受柱阻影響泵壓可達(dá)400kg/cm2輸出的脈沖性較大，現(xiàn)多采用雙泵系統(tǒng)來克服液缸容積小，可至0.1ml，因此易于清洗更換流動相，特別適合再循環(huán)和梯度洗脫當(dāng)前第13頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)三分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)*色譜柱連接管恒溫器當(dāng)前第14頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)色譜柱柱效高選擇性好分析速度快當(dāng)前第15頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)進(jìn)入色譜柱樣品的處理當(dāng)前第16頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)

色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。①避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動。②應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成。③一般說來色譜柱不能反沖，會迅速降低柱效。

當(dāng)前第17頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)④選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。⑤需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。

⑥經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。

柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)

當(dāng)前第18頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)四檢測系統(tǒng)當(dāng)前第19頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)要求靈敏度高

噪音低

適用范圍廣重復(fù)性好

當(dāng)前第20頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)UV檢測器當(dāng)前第21頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)數(shù)據(jù)處理和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)恒溫裝置在HPLC儀中色譜柱及某些檢測器都要求能準(zhǔn)確地控制工作環(huán)境溫度，柱子的恒溫精度要求在±0.1~0.5℃之間，檢測器的恒溫要求則更高。采集處理分析數(shù)據(jù)控制儀器色譜系統(tǒng)優(yōu)化當(dāng)前第22頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)流動相的要求反相色譜流動相以水作為基礎(chǔ)溶劑，再加入一定量的能與水互溶的非極性調(diào)整劑，常用的是甲醇和乙腈。一般情況下甲醇-水已經(jīng)能夠滿足多種樣品的分離，粘度小，價格低。但推薦乙腈-水做初始實(shí)驗(yàn)，與甲醇比，乙腈的溶劑強(qiáng)度高粘度小，并可滿足185-205nm處檢測的要求。與檢測器相適應(yīng)溶劑的純度

粘度小

沸點(diǎn)低固體殘留物少

與色譜系統(tǒng)相適應(yīng)當(dāng)前第23頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)流動相的準(zhǔn)備調(diào)整PH根據(jù)所分離蛋白質(zhì)及色譜柱決定流動相脫氣濾膜過濾目前實(shí)驗(yàn)室主要用的是超聲15min左右溶劑使用前都必須經(jīng)0.45μm濾膜過濾，以除去雜質(zhì)微粒。分清有機(jī)相濾膜和水相濾膜，對于混合流動相，在混合前過濾當(dāng)前第24頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)合適的波長合適的柱溫蛋白樣品的性質(zhì)當(dāng)前第25頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)HPLC與其他色譜光譜技術(shù)的聯(lián)用CEMSUFCECEMSHPLC當(dāng)前第26頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)高效液相色譜—質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)和蛋白質(zhì)酶譜研究的重要手段，通過質(zhì)譜可以實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)的自動分離檢測。高效液相色譜—毛細(xì)管電泳當(dāng)毛細(xì)管電泳與HPLC聯(lián)用時，兩者各自優(yōu)勢都得以發(fā)揮。HPLC—CE聯(lián)用技術(shù)特別適合細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)的分離當(dāng)前第27頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)反相高效液相色譜法對血清中胰島素的測定應(yīng)用實(shí)例色譜柱流動相梯度洗脫其他C5柱(100mm*4.6mm5μm，Ph-enomenex公司，美國A相:10mmol/LTris緩沖液(pH8.5);B相:乙腈;流速:1mL/minB相體積分?jǐn)?shù)變化為:0～15min,15%～25.5%;15～21min,25.5%。進(jìn)樣量20μL柱溫25℃當(dāng)前第28頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)當(dāng)前第29頁\共有31頁\編于星期六\11點(diǎn)高效液相色譜目前多用于蛋白質(zhì)的定量分析，對于大樣品的分離純