淺論慢性低氧高二氧化碳對(duì)小鼠骨骼肌形態(tài)的影響

淺論慢性低氧高二氧化碳對(duì)小鼠骨骼肌形態(tài)的影響【摘要】目的:觀察慢性低氧高二氧化碳小鼠股外側(cè)肌顯微、超微結(jié)構(gòu)的變化，探討慢性低氧高二氧化碳對(duì)小鼠骨骼肌形態(tài)的影響。方法：將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組建立慢性低氧高二氧化碳小鼠動(dòng)物模型。觀察兩組體重變化；光鏡觀察小鼠股外側(cè)肌細(xì)胞形態(tài)、炎性細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等變化；透射電鏡觀察肌纖維走向、形態(tài)及線粒體損害等超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果：與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠體重下降；肌纖維局部萎縮，肌纖維排列紊亂；炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，脂肪沉積增多；肌細(xì)胞線粒體增多伴內(nèi)部結(jié)構(gòu)明顯破壞。結(jié)論：慢性低氧高二氧化碳血癥可導(dǎo)致小鼠的肌纖維萎縮和線粒體損害，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

【關(guān)鍵詞】低氧；高碳酸血癥；骨骼??；顯微結(jié)構(gòu)；超微結(jié)構(gòu)；小鼠

Abstract:Objective:Toobservethechangesofpathologicmorphousandultrastuctureinthevastuslateralisofmiceexposedtochronichypoxia-hypercapnia.Methods:C57BL/6micewereassignedrandomlyintocontrolgroupandexperimentgroup.Animalmodelofchronichypoxia-hypercapniawasbuiltinexperimentgroup.Musclecellsandinflammatorycellswereobservedbylightmicroscopy.Theultrastureofmusclecellandmuscle’smitochondriawereobservedbyelectronmicroscope.Results:Comparedwiththatincontrolgroup，weighlossesofmicewerepresentedinexperimentgroup.Inexperimentgroup，musclesatrophyandderangement，inflammatorycellsinfiltrationandincrementoffattydepositionwereobserved.Thenumberofmitochondriawasincreasedandtheirinternalstructuresweredestroyedinexperimentgroup.Conclusion:Miceexposuretohypoxia-hypercapniacaninducetheirmusclesatrophy，muscles’mitochondriadestroyandinflammatorycellsinfiltration.

Keywords:hypoxia；hypercapnia；skeletalmuscle；microstructure；ultrastructure；mice

慢性阻塞性肺疾病是以不完全可逆的氣流受限為特征的肺部疾病，但越來越多的研究表明，COPD的病變還累及多個(gè)肺外器官。骨骼肌功能障礙是其較為突出的肺外病變之一，它嚴(yán)重影響COPD患者運(yùn)動(dòng)能力和生活質(zhì)量。其發(fā)病機(jī)制仍不清楚，估計(jì)病因主要集中在肌纖維的再分布和能量代謝酶活性改變等方面[1]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)MCOPD發(fā)病機(jī)制，觀察在常壓慢性低氧高二氧化碳條件下，小鼠股外側(cè)肌顯微、超微結(jié)構(gòu)變化，旨在探討低氧高二氧化碳對(duì)骨骼肌形態(tài)學(xué)改變的影響。

1材料和方法

動(dòng)物與分組SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠，體重20～28g，6～8周齡，按隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組8只。

試劑與儀器TECNAI10透射電子纖維鏡，超薄切片機(jī)，戊二醛，四氧化鋨，EPON812(分析純，日本)，蘇木素，伊紅，其余為國(guó)產(chǎn)分析純。

低氧高二氧化碳小鼠模型的建立參照陳鳴和等建立的方法。

骨骼肌標(biāo)本取材兩組動(dòng)物成模后，稱體重，予1%水合氯醛腹腔麻醉后處死，取小鼠右側(cè)股外側(cè)肌2份，1份行常規(guī)HE染色，1份電鏡超薄切片。

光鏡切片的制備和觀察組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，8μm切片。切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)乙醇至水洗，蘇木素染色2min，以1%鹽酸酒精分化30s，流水沖洗返藍(lán)25min，%伊紅染色5min，行常規(guī)脫水、封片。在HPLAS1000彩色圖像處理系統(tǒng)下對(duì)骨骼肌炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、骨骼肌纖維斷裂、壞死、脂肪沉積、肌膜核內(nèi)移等進(jìn)行觀察。

電鏡超薄切片的制備和觀察將骨骼肌標(biāo)本用鋒利刀片修成1mm3組織方塊，以%戊二醛電鏡專用固定液固定2h，PBS緩沖液沖洗1次，1%鋨酸后固定60min，行常規(guī)脫水、浸透、包埋、超薄切片、鉛鈾染色。TECNAI10透射電鏡下觀察取得圖像，也在圖像分析系統(tǒng)下對(duì)骨骼肌肌纖維排列、肌纖維萎縮、纖維溶解和線粒體等進(jìn)行觀察。

以上光鏡和電鏡下觀察操作均由同一位病理醫(yī)生在不知道實(shí)驗(yàn)分組的情況下進(jìn)行，參照Cross方法評(píng)分以0為無明顯損害，+為輕微的損害，++為中度損害，+++為重度損害為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)判，每張圖像均重復(fù)觀察2次保證實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性和病理診斷的正確性。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法計(jì)量數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)，半定量數(shù)據(jù)用卡方檢驗(yàn)，兩次觀察結(jié)果用Kappa分析其結(jié)果的一致性。

2結(jié)果

對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組小鼠體重變化比較對(duì)照組小鼠體重造模前后體重變化為g，實(shí)驗(yàn)組小鼠體重造模前后體重變化為g，差異有極顯著性。

骨骼肌顯微結(jié)構(gòu)觀察光鏡下可見對(duì)照組小鼠骨骼肌肌纖維形態(tài)正常，實(shí)驗(yàn)組小鼠骨骼肌纖維局部萎縮，肌纖維間炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增多，輕微脂肪沉積，未發(fā)現(xiàn)明顯肌纖維斷裂、壞死，肌膜核內(nèi)移。肌肉顯微病理嚴(yán)重程度評(píng)分情況見表1。

骨骼肌超微結(jié)構(gòu)觀察透射電鏡下可見對(duì)照組骨骼肌肌節(jié)結(jié)構(gòu)正常，肌絲排列有序，線粒體結(jié)構(gòu)正常。實(shí)驗(yàn)組小鼠肌纖維局部明顯萎縮變細(xì)，肌原纖維走行紊亂，Z線漂移，線粒體濃聚，但線粒體腫脹，排列紊亂，膜部分消失，嵴不規(guī)則斷裂。肌肉超微病理嚴(yán)重程度評(píng)分情況見表2。

3討論

骨骼肌功能障礙作為COPD主要的肺外病變之一，和患者病死率等預(yù)后因素密切相關(guān)。COPD骨骼肌功能障礙的發(fā)病機(jī)制仍未完全清楚，目前為數(shù)不多的研究主要集中在臨床研究。由于有眾多的因素能影響COPD患者骨骼肌功能，比如：有否吸煙，戒煙時(shí)間長(zhǎng)短，低氧高二氧化碳嚴(yán)重程度，發(fā)病前患者肌肉情況、營(yíng)養(yǎng)情況，發(fā)病后伴發(fā)的疾病情況，治療時(shí)有否使用糖皮質(zhì)激素等，臨床研究中對(duì)照組的選擇標(biāo)準(zhǔn)等錯(cuò)綜復(fù)雜，難以統(tǒng)一，所以不同研究者得出不同的甚至相反的研究結(jié)果，可能與此有關(guān)。因此有必要進(jìn)行容易控制對(duì)照因素的基礎(chǔ)動(dòng)物研究。

本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠體重下降，顯微、超微鏡下局部肌纖維萎縮，可以初步得出低氧高二氧化碳能造成小鼠骨骼肌萎縮，至少是局部肌萎縮的結(jié)論，而且肌纖維間脂肪細(xì)胞的沉積也間接地證明了這點(diǎn)。這與臨床的研究結(jié)果是相符合的。慢性低氧高二氧化碳條件下骨骼肌的萎縮雖然在一定范圍內(nèi)能起到適應(yīng)性的作用：減少局部氧耗，使肌肉纖維間毛細(xì)血管密度相對(duì)增加，縮小氧彌散距離等，但骨骼肌的萎縮勢(shì)必影響骨骼肌的容積，進(jìn)而導(dǎo)致骨骼肌肌力下降。

同時(shí)本研究也顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠股外側(cè)肌肌纖維間炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增多，提示COPD骨骼肌功能障礙的發(fā)病機(jī)制和炎癥有密切關(guān)系。目前的臨床研究也有報(bào)道稱在COPD患者血液及骨骼肌本身均可以發(fā)現(xiàn)炎癥遞質(zhì)和炎性細(xì)胞增多，并認(rèn)為這些增多的炎癥物質(zhì)能通過影響骨骼肌蛋白的降解、合成或通過直接影響骨骼肌收縮導(dǎo)致骨骼肌功能障礙。本研究還觀察到實(shí)驗(yàn)組小鼠骨骼肌線粒體濃聚、腫脹、排列紊亂，線粒體膜部分消失，嵴斷裂。線粒體內(nèi)集中了體內(nèi)絕大部分與氧化代謝有關(guān)的酶，是機(jī)體的主要產(chǎn)能器官。肌肉有兩種線粒體：①位于肌纖維之間的線粒體，②位于肌膜下的線粒體。其中肌纖維間線粒體占體內(nèi)75%以上，肌肉收縮能量主要來源于此。本研究中線粒體濃聚現(xiàn)象可能是慢性低氧高二氧化碳下機(jī)體的一種適應(yīng)性改變，但由于線粒體出現(xiàn)腫脹、排列紊亂、線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞等改變，從而使線粒體產(chǎn)生能量的能力下降，肌肉的氧化代謝能力下降，進(jìn)而使骨骼肌耐力下降。這也許可以解釋某些骨骼肌萎縮不明顯的COPD患者出現(xiàn)骨骼肌功能障礙的原因。

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