動物基因工程

關(guān)于動物基因工程第1頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三第一節(jié)基因工程概述

基因工程(Geneticengineering)是一種DNA重組技術(shù)，它是在分子水平上進(jìn)行的遺傳操作，即把供體細(xì)胞中的基因或基因組提取出來，按照預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，經(jīng)過體外加工重組，或者把人工合成的基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞并獲得新的遺傳特性的技術(shù)。由于被轉(zhuǎn)移的基因必須與載體DNA重組后才能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移，所以基因工程也叫做重組DNA技術(shù)?；蚬こ痰幕静僮鞒绦虬ǎ?1)目的基因的分離或合成；(2)用工具酶對目的基因和載體（Vector）進(jìn)行加工處理，把目的基因與載體結(jié)合成重組DNA分子；(3)把重組DNA分子引入受體細(xì)胞，并使目的基因和載體上其他基因得以表達(dá)；（4）轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的擴(kuò)增；（5）重組體細(xì)胞的鑒定與篩選。第2頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三基因克隆示意圖第3頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三第二節(jié)工具酶限制性核酸內(nèi)切酶切割DNADNA連接酶生成3′-5′磷酸二酯鍵DNA聚合酶Ⅰ探針標(biāo)記、補(bǔ)平3′末端反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶3′末端多聚尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基常用的工具酶第4頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三限制性核酸內(nèi)切酶細(xì)菌限制修飾體系

限制性核酸內(nèi)切酶甲基化酶識別特異的位點(diǎn)—酶切位點(diǎn)回文結(jié)構(gòu)4～6bp出現(xiàn)兩種末端粘性末端粘端

平頭末端平端

配伍末端第5頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三二、DNA聚合酶

（一）DNA聚合酶I(全酶)(E.coliDNAPolymease)（二）K1enow片段(E.co1i)

（三）T4DNA聚合酶(T4噬茵體感染的E．co1i)（四）TaqDNA聚合酶(Thermusaqraticus)（五）逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）

（六）末端轉(zhuǎn)移酶

第6頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三三、DNA連接酶

在大腸桿菌和動物細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶，這種酶能夠催化DNA中相鄰的3’一OH和5’一磷酸基末端之間形成磷酸二酯鍵。連接反應(yīng)的最適溫度是37℃，但在此溫度下粘性末端之間氫鍵結(jié)合很不穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)表明，15℃對于連接反應(yīng)和粘性末端氫鍵結(jié)合的穩(wěn)定性都是合適的。四、甲基化酶細(xì)胞的限制一修飾系統(tǒng)中的修飾作用是由甲基化酶(methylase)米完成的。甲基化酶同限制性內(nèi)切酶具有完全相同的識別順序。甲基化酶使識別順序中的某個堿基發(fā)生甲基化，保護(hù)DNA不被限制性內(nèi)切酶切開。真核生物中目前只發(fā)現(xiàn)5甲基胞嘧啶(M5C)。第7頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三

五、核酸酶

（一）核酸酶S1(NucleaseS1)核酸酶S1主要用于：(1)分析DNA：RNA雜交體結(jié)構(gòu)。通過降解成熟mRNA與放射性標(biāo)記基因組、DNA的雜交體確定內(nèi)含子部位。(2)切除DNA片段上的單鏈末端，形成平末端。(3)切開cDNA合成過程中形成的發(fā)夾環(huán)。(4)在限制酶位點(diǎn)上產(chǎn)生小缺失。(二)核酸外切酶III（三）核酸外切酶VII（四）DNA酶I（五）RNA酶A(牛胰)（六）RNA酶TI

（七）RNA酶H第8頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三第三節(jié)基因工程的載體（Vector）

到目前為止，用于基因工程的載體有8類：

①

細(xì)菌質(zhì)粒載體；包括大腸桿菌和枯草桿菌質(zhì)粒載體。②

λ噬菌體衍生載體。③

柯斯質(zhì)粒(Cosmid)載體：一種由質(zhì)粒和A噬菌體cos尾巴構(gòu)建的復(fù)合載體。④

噬菌體M13衍生載體一類專門用于Sanger法測序的載體。⑤

Phag9m5d載體：一類由噬菌體功能片段和質(zhì)粒構(gòu)建的復(fù)合載體。⑥

酵母質(zhì)粒載體：由酵母2u質(zhì)粒構(gòu)建的酵母基因工程載體。⑦

真核病毒載體：包括動物病毒、植物病毒衍生載體。⑧

桿狀病毒和Bacmid載體；

第9頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三作為基因工程的載體它們都具備以下一些共同的基本特點(diǎn)：

作為基因工程的載體它們都具備以下一些共同的基本特點(diǎn)：

①在宿主細(xì)胞中能獨(dú)立自主地復(fù)制。

②表達(dá)載體含有強(qiáng)啟動于，能驅(qū)動靶基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)。

③容易從宿主細(xì)胞中分離純化。

④載體DNA基因組中有一段不影響它們復(fù)制的非必需區(qū)域，插在其中的靶片段能被動地跟著載體DNA一起復(fù)制，就像載體的正常成分一樣。第10頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三一、質(zhì)粒載體(plasmidvector)

（1）質(zhì)粒的一般性質(zhì)1．質(zhì)粒的概念

質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞染色體外存在于細(xì)胞質(zhì)中能進(jìn)行自我復(fù)制的一類小型DNA分子，大部分質(zhì)粒為雙鏈環(huán)狀。2．質(zhì)粒的大小

3．質(zhì)粒的拷貝數(shù)

4．質(zhì)粒的不親和性

5．質(zhì)粒的宿主范圍

第11頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三質(zhì)粒—存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子理想的質(zhì)粒

1.拷貝數(shù)多;2.兩三個抗藥性基因terrampr

篩選標(biāo)志3.合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)（單一）第12頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三第13頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三（二）噬菌體載體(Phagevector)

噬菌體是一種溫和噬菌體，由于它的遺傳結(jié)構(gòu)和宿主大腸桿菌的遺傳結(jié)構(gòu)研究得比較清楚，并能在細(xì)菌中大量繁殖，所以成為廣泛采用的載體。噬菌體還有一大優(yōu)點(diǎn)，即使它的DNA丟失25％仍不失活，這部分丟失的空檔正好可以裝載外源DNA。與質(zhì)粒載體相比，λ噬菌體作為載體可以克隆更大一些的DNA片段，欲構(gòu)件一個基因文庫，往往可以減少文庫中克隆的數(shù)量。第14頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三（三）柯斯質(zhì)粒載體（Cosmidvector）

柯斯質(zhì)粒載體又叫粘粒載體，這是一種由人工構(gòu)建的含有DNA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體?？滤官|(zhì)粒在結(jié)構(gòu)組成上具有噬菌體的特性、也具有質(zhì)粒載體的特性和高容量的克隆能力，一般可插入35～40kb的外源基因，這是構(gòu)建真核生物基因文庫的主要載體。柯斯質(zhì)粒適用于作基因簇和大基因的克隆。

第15頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三（四）YAC載體

YAC是酵母人工染色體（Yeastartificialchromosome）的縮寫，是目前能容納最大外源DNA片段的載體。簡單地說，酵母人工染色體載體有兩個臂，之間有著絲粒，每個臂的末端有一個端粒，另外，染色體上還有供選擇的標(biāo)記基因；當(dāng)外源DNA片段連接進(jìn)兩個臂中以后，通過選擇標(biāo)記人們可以從酵母宿主細(xì)胞中篩選出重組的人工染色體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，每個YAC都可以裝進(jìn)100萬堿基以上的DNA片段，這種大小比柯斯質(zhì)粒的裝載能力要大數(shù)倍，所以可以保證基因結(jié)構(gòu)的完整性。第16頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三(五)動物病毒

動物病毒作為載體可用于外源基因向真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)入。作為基因介導(dǎo)的動物DNA載體，必須具備以下條件：(1)具有動物病毒的復(fù)制起始部位及啟動子，以便外源基因能有效的轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞，以及提供必要的轉(zhuǎn)錄信號：(2)具有可供選擇的標(biāo)志基因，因?yàn)橹亟ǖ牟《巨D(zhuǎn)染力很低，一般僅為105～107，只有利用標(biāo)志基因才能選出轉(zhuǎn)化細(xì)胞株；(3)具有適當(dāng)?shù)亩喾N單一內(nèi)切酶位點(diǎn)供外源基因插入。

目前常用的基因轉(zhuǎn)移載體有：(1)猴空泡病毒(Simianvirus40簡稱SV40)；(2)腺病毒(Adenovirus)；(3)乳頭狀病毒(Papillomavirus)；(4)逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus);(5)牛痘(Vaccinia)病毒;(6)牛疣病毒(Bovinepapillomavirus)等。第17頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三

三、獲得目的基因的方法

(一)利用理化方法分離基因理化方法分離基因是依據(jù)DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)和四種堿基互補(bǔ)的氫鍵差異，其方法有以下四種：1．密度梯度超速離心法2．單鏈酶法3．多聚賴氨酸法4．分子雜交法第18頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三(二)利用生物學(xué)方法分離基因利用噬菌體轉(zhuǎn)染或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化等微生物學(xué)技術(shù)分離基因的方法，我們把它叫做生物學(xué)方法。這種方法應(yīng)用于原核基因的分離提取。用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶(Restrictionendonuclease)將整個染色體或DNA分子切成許多相當(dāng)于一個或略大于一個基因的片段，然后把全部DNA片段與質(zhì)粒組成重組DNA分子，并轉(zhuǎn)化到某特定基因營養(yǎng)缺陷型受體菌內(nèi)，進(jìn)行純系繁殖，再經(jīng)分離鑒定，選出所需基因。第19頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三(三)基因的人工合成

化學(xué)合成法逆轉(zhuǎn)錄法(Reversetranscription)

逆轉(zhuǎn)錄法也叫cDNA法，它是一種酶促合成法，即以mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以四種脫氧核苷三磷酸為材料合成DNA(cDNA)，再經(jīng)復(fù)制后即成雙鏈DNA。3.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)第20頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三四、重組DNA分子

1.粘性末端連接連接效率高相同酶切末端配伍末端2.平端連接連接效率低3.同聚物接尾法4.人工接頭法第21頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三第22頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三五、基因的轉(zhuǎn)移(Genetransfer)

(一)、重組DNA向細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)入

把以質(zhì)粒為載體的重組DNA分子引入受體細(xì)胞的過程叫做轉(zhuǎn)化(Transformation)；把以噬菌體或病毒為載體的重組DNA分子引入受體細(xì)胞的過程叫做轉(zhuǎn)染(Transfetion)。對細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵是細(xì)胞處在感受態(tài)，所謂感受態(tài)細(xì)胞，就是受體細(xì)胞處于攝入外源DNA的狀態(tài)。一般用0.01～0.05M/L氯化鈣處理受體細(xì)胞，可以引起細(xì)胞膨脹，增大細(xì)胞的通透性，使重組DNA進(jìn)入細(xì)胞，提高轉(zhuǎn)化效率。第23頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三轉(zhuǎn)導(dǎo)作用transduction病毒、噬菌體介導(dǎo)溶菌途徑溶原菌途徑第24頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三(二)、外源目的基因向真核細(xì)胞轉(zhuǎn)入

向真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)移基因的方法可分為兩大類，—類需借助于載體，另—類不需借助于載體。1．

借助于載體的基因轉(zhuǎn)移2．不需載體的基因轉(zhuǎn)移①

磷酸鈣沉淀法②脂質(zhì)體介導(dǎo)法③血影細(xì)胞(Bloodshadowcell)介導(dǎo)法

第25頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三六、轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選與鑒定

轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的效率是很低的(一般為105～106)，也就是說，只有極少數(shù)細(xì)胞接受到重組DNA分子，能實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。所以必須從大量的培養(yǎng)細(xì)胞中篩選出已被外源DNA轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞，然后建立無性繁殖系，使所需基因大量擴(kuò)增和表達(dá)。

第26頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三重組體的篩選screening/selection1.直接選擇法

抗藥性標(biāo)志選擇

標(biāo)志補(bǔ)救表達(dá)產(chǎn)物與營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)α—互補(bǔ)藍(lán)白斑篩選

分子雜交探針原位雜交/Southern印跡法

限制性酶切圖譜/PCR2.非直接選擇法免疫學(xué)方法第27頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三七克隆基因的表達(dá)載體有轉(zhuǎn)錄、翻譯的元件密碼子通用1、原核表達(dá)體系

原核表達(dá)載體的標(biāo)準(zhǔn)合適的篩選標(biāo)志強(qiáng)啟動子翻譯控制序列多克隆位點(diǎn)第28頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三融合蛋白包涵體大腸桿菌表達(dá)體系的不足缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機(jī)制，只能表達(dá)cDNA缺乏翻譯后加工機(jī)制，不能折疊和糖基化融合蛋白形成包涵體，復(fù)性后才有活性很難表達(dá)大量的可容性蛋白第29頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三第30頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三真核表達(dá)體系

篩選標(biāo)志NeorG418轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣沉淀DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染顯微注射瞬時轉(zhuǎn)染目的基因不整合進(jìn)宿主基因組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因整合進(jìn)宿主基因組

第31頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三第三節(jié)轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)

一、轉(zhuǎn)基因動物的概念

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞的一種技術(shù)。它是在DNA重組技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。1981年Gordon和Ruddle首次用顯微注射法(Microinjection)把外源基因?qū)胄∈笫芫训男酆?，并將注射后的受精卵植入假孕母鼠子宮，產(chǎn)生了的78只小鼠，其中有2只的所有細(xì)胞中(包括生殖細(xì)胞)都含有外源基因，但因缺乏啟動子而不能表達(dá)，他們把出生后帶外源基因的小鼠叫做轉(zhuǎn)基因小鼠(TransgenicMice)，自此以后，凡帶有外源基因的動物都叫做轉(zhuǎn)基因動物(Transgenicanimal)。第32頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三二、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的一般步驟

(1)選擇能有效表達(dá)的蛋白質(zhì)；(2)克隆與分離編碼這些蛋白質(zhì)的基因；(3)選擇能與所需組織特異性表達(dá)方式相適應(yīng)的基因調(diào)節(jié)序列；(4)把調(diào)節(jié)序列與結(jié)構(gòu)基因重組拼接，并在培養(yǎng)細(xì)胞或小鼠中預(yù)先檢驗(yàn)其表達(dá)情況；(5)把拼接的基因注射到受精卵的細(xì)胞核中；(6)把注射后的受精卵移植到子宮，完成胚胎發(fā)(7)檢測幼畜是否整合外源基因、外源