冰片促丹參素到達(dá)兔眼內(nèi)能力的實(shí)驗(yàn)研究

冰片促丹參素到達(dá)兔眼內(nèi)能力的實(shí)驗(yàn)研究冰片的作用冰片具有通諸竅,散郁火,去翳明目,消腫止痛之功能。冰片較少單獨(dú)應(yīng)用,常作為“引藥”,以增加其它藥物的治療效果,即中醫(yī)所謂的“芳香走竄,引藥上行”“獨(dú)行則勢弱,佐使則有功”。血眼屏障血視網(wǎng)膜屏障血房水屏障血視神經(jīng)屏障其結(jié)構(gòu)和功能與BBB相似，這些屏障有一個(gè)共同的特點(diǎn)，就是血管內(nèi)的小分子物質(zhì)可以通過，而血液中的成分和大分子物質(zhì)則不能通過血管壁而到達(dá)房水或視網(wǎng)膜內(nèi)。

這些屏障的的存在，也同時(shí)限制了許多治療性藥物的通透性，在組織內(nèi)達(dá)不到治療濃度，限制了某些藥物的治療作用，如果加大藥物的劑量勢必會(huì)使藥物的副作用加大.丹參素具有改善微循環(huán)和抗自由基的作用材料與方法動(dòng)物與試劑

110健康家兔,體重2.2-2.5kg，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供,溫度(22±3)℃、濕度(65±5)%丹參素標(biāo)準(zhǔn)品購于中國藥品檢驗(yàn)檢定所冰片購于北京同仁堂藥店高效液相色譜儀:HP1100LC-2010A,AgilentCo.,USA將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為兩組：丹參素組和丹參+冰片組每組再分為11組(血漿組,5,15,25,35,45,60,120,270,600and900分鐘組)

實(shí)驗(yàn)組（冰片+丹參）血漿亞組：給予冰片（溶于95%乙醇稀釋成40mg/100ml）口服灌胃15分鐘后，給予中藥丹參凍干粉（）+0.85%生理鹽水20ml右耳緣靜脈推注。實(shí)驗(yàn)組的血漿亞組每只動(dòng)物在丹參給藥后0、5、10、20、30、45、60、90、120min于家兔左耳緣靜脈采血1.5ml。眼內(nèi)亞組在給藥后5、15、25、35、45、60、120、270、600、900min處死動(dòng)物，用0.85%生理鹽水快速充分沖洗結(jié)膜囊，然后用1ml注射器在角膜緣內(nèi)1ml刺入前房抽取房水（每次更換注射器）。冷藏，12h內(nèi)送檢。檢測房水和玻璃體內(nèi)丹參的水溶性標(biāo)志成分丹參素（Dhpl）的含量。對照組給予與實(shí)驗(yàn)組對應(yīng)劑量95%乙醇口服灌胃15分鐘后給予中藥丹參凍干粉（）+0.85%生理鹽水20ml右耳緣靜脈推注。其他實(shí)驗(yàn)方法與實(shí)驗(yàn)組相同。供試品溶液的制備上述方法得到的全血，以3000轉(zhuǎn)/min離心10min，取血漿取血漿樣品0.2ml，加1%醋酸0.08ml，1mol/L鹽酸0.08ml，混勻，加乙酸乙酯2ml，漩渦混合提取2min，離心(10000r/min)5min。分取有機(jī)層1.5ml，45℃水浴上通空氣流揮干。臨用前殘?jiān)?ml流動(dòng)相溶解，超聲震蕩20min，漩渦混合2min，離心(12000r/min)10min，取上清液備用。房水同血漿。色譜條件色譜柱THERMO(日電)，HypersilBDSC18，(5μm4.6mm×250mm);預(yù)柱:

自填國產(chǎn)YWGC18；流動(dòng)相為乙腈：0.01?/L磷酸二氫鉀（8：92）用磷酸緩沖液調(diào)；紫外檢測波長279nm；流速；柱溫為室溫。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備配制標(biāo)準(zhǔn)工作液

精密稱取丹參素對照品適量，加1%醋酸配成濃度為1mg/ml的貯備液，4℃保存。臨用前，取丹參素貯備液適量，用1%醋酸溶液按倍數(shù)稀釋法稀釋至所需濃度，即得丹參素的標(biāo)準(zhǔn)工作液。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

兔血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

兔房水標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

兔玻璃體標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備線性關(guān)系（1）血漿線性關(guān)系按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”方法測得丹參素的峰面積(Yd)與丹參素血漿濃度(Xd)在～1000μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，，γ=0.9999。結(jié)果見圖1。圖1丹參素的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure1Standardcurveofdanshensu(Dhpl)inplasma房水線性關(guān)系按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”方法測得丹參素的峰面積(Yd)與丹參素房水濃度(Xd)在～50μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，，。結(jié)果見圖2。圖2丹參素的房水標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure2Standardcurveofdanshensu(Dhpl)inaqueous玻璃體線性關(guān)系

測得丹參素的峰面積(Yd)與丹參素房水濃度(Xd)在0.0781-2.5μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，，。樣品測定方法（1）血漿：精密吸取供試品溶液20μl注入液相色譜儀，記錄丹參素的峰面積，以丹參素峰面積為定量指標(biāo)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求算相應(yīng)的血藥濃度。（2）房水、玻璃體：精密吸取供試品溶液100μl注入液相色譜儀，記錄丹參素的峰面積，以丹參素峰面積為定量指標(biāo)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求算相應(yīng)的房水和玻璃體藥濃度。結(jié)果兔空白血漿加入標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖給藥120min后兔血漿色譜圖給藥25min后兔房水色譜圖血漿內(nèi)Dhpl的測定時(shí)間n對照組實(shí)驗(yàn)組t檢驗(yàn)

不同時(shí)間點(diǎn)對照組、實(shí)驗(yàn)組房水Dhpl濃度(μg/ml)時(shí)間n對照組實(shí)驗(yàn)組t檢驗(yàn)

600min00900min00不同時(shí)間點(diǎn)對照組、實(shí)驗(yàn)組玻璃體Dhpl濃度(μg/ml)時(shí)間n對照組實(shí)驗(yàn)組t檢驗(yàn)

5min100.2014±0.04750.5977±0.0874p＜15min100.4564±0.08460.7345±0.0718p＜25min100.7503±0.11601.132±0.1786p＜35min100.5067±0.10180.7345±0.0993p＜45min100.5722±0.08760.8080±0.1104p＜60min100.4818±0.10190.7147±0.1178p＜120min100.6022±0.11470.8544±0.1277p＜270min100.3495±0.08020.4309±0.0928p＜600min100.1720±0.05340.2200±0.0571p＜900min100.0979±0.02020.1188±0.0305p＜0.05結(jié)論我國傳統(tǒng)醫(yī)藥歷史悠久，幾千年來，人們就一直應(yīng)用中草藥治療各種疾病，隨著醫(yī)學(xué)進(jìn)展，中西醫(yī)結(jié)合的方法在眼科臨床治療中收到了良好的效果。丹參始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,被列為上品,歷代本草均有收載。具祛瘀止痛,活血通經(jīng),清心除煩之功效。是現(xiàn)代臨床常用的活血化瘀藥物,在眼科用于視網(wǎng)膜動(dòng)、靜脈阻塞、眼底出血、視神經(jīng)病變等方面具有較好作用。研究表明,丹參的水溶性成分主要為酚性芳香酸類化合物,多含有苯丙烷結(jié)構(gòu),以及該類酸縮合形成的多酚芳酸，主要有丹參酸甲(丹參素)、丹參酸乙、丹參酸丙、原二茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C和迷迭香酸等。中華人民共和國藥典明確寫明丹參素是丹參水溶性成分中的主要藥效成分，既丹參的標(biāo)志性成分。又因?qū)嶒?yàn)注射所用丹參凍干粉為復(fù)方丹參水溶性制劑，故本研究中把丹參素(Dhpl)作為示蹤目標(biāo)從而觀察丹參是科學(xué)的?？疾炝艘韵铝鲃?dòng)相對給藥后血漿樣品測定的影響，流動(dòng)相A:甲醇—水—冰醋酸(17∶82∶1);流動(dòng)相B:乙腈—0.01mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(8∶92)(磷酸調(diào)至pH2.8);流動(dòng)相C:乙腈—水—冰醋酸(9∶90∶1)。結(jié)果表明,只有流動(dòng)相B使丹參素達(dá)到了基線分離,且極性較小的酚酸類成分基本不干擾樣品中丹參素的測定。由于丹參素為酸性化合物,因此考察了不同酸度流動(dòng)相(pH2.8,3.8及4.8)對分離的影響。結(jié)果表明,當(dāng)pH2.8時(shí),由于離解被抑制,丹參素分離較好,色譜峰的對稱性明顯改善。本實(shí)驗(yàn)采用液-液萃取法，考察了萃取溶劑(乙酸乙酯)用量及酸度對萃取的影響。結(jié)果表明,于血漿、房水0.2mL中加入1mol·L-1鹽酸0.08mL,將pH調(diào)至1.5,用乙酸乙酯2mL萃取,于玻璃體0.5mL中加入1mol·L-1鹽酸0.2mL,用乙酸乙酯5mL萃取，丹參素可被較好地萃取。丹參素高、中、低3種濃度的平均萃取回收率均在75%以上，且又經(jīng)過組分的分離及濃集等處理過程，去除了干擾測定的雜質(zhì)，并使被測組分濃集。此方法可靠，結(jié)果穩(wěn)定，符合生物樣品測定要求。血-房水屏障由睫狀體無色素上皮的緊密連接、虹膜組織的連接和虹膜血管組成，就像一張有微孔半徑105μm的半透性膜。血-房水屏障的存在使房水與血液的成分及其質(zhì)量濃度不同，藥物能否到達(dá)房水取決于其能否通過血—房水屏障。血-視網(wǎng)膜屏障是視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮、視網(wǎng)膜色素上皮間、睫狀體無色素上皮間的緊密連接復(fù)合體。丹參素在玻璃體內(nèi)的吸收情況未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中藥復(fù)方丹參靜脈注射后能夠通過血-眼屏障到達(dá)房水及玻璃體，但通透性相對較差，在血中的高峰濃度是房水中高峰濃度的20倍，玻璃體的800倍。冰片的相對分子量為，為小分子脂溶性單萜類物質(zhì)，在胃部吸收迅速，進(jìn)入體循環(huán)后極易通過血腦屏障而進(jìn)入腦內(nèi)，[14,15]實(shí)驗(yàn)證實(shí)，小鼠口服冰片5min后即可進(jìn)入腦組織，冰片血清和腦組織中的達(dá)峰濃度分別是20min和45min，所以本實(shí)驗(yàn)選擇在冰片灌胃15min使冰片在血液中一定濃度后靜脈注射復(fù)方丹參，以便發(fā)揮冰片的最佳促滲透作用。從實(shí)驗(yàn)可以看出，丹參素與冰片合用，檢測血清中作為示宗物質(zhì)的丹參素，