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文檔簡介

重組DNA大腸埃希菌俗名大腸桿菌是人和動物腸道中最主要的細菌之一是正常菌群的成員出生后數(shù)小時就進入腸道,并伴隨終生能合成維生素B和K,供人體利用能抑制腐敗菌及病原菌(如金黃色葡萄球菌、志賀菌屬)真菌(如白念珠菌)的過度增殖異位寄居時可引起腸外感染某些菌株有致病性—消化道感染,導致腹瀉等每個人每天平均從糞便中排出1011到1013個可作為糞便污染的檢測指標常作為細菌的模式生物廣泛用于科學研究基因工程的工具菌生物學性狀形態(tài)與染色G-

桿菌,1~3μm(短桿菌)兩端鈍圓、無芽孢有周鞭毛有普通菌毛/性菌毛能運動衛(wèi)生細菌學檢查大腸菌群指37OC24h內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣包括埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬及腸桿菌屬等大腸菌群指數(shù)指1000ml被檢樣品中的大腸菌群數(shù)生活飲用水的水質(zhì)標準coli-index≤3個我國2007年開始實施的衛(wèi)生標準規(guī)定每100ml生活飲用水中,不得檢出總大腸菌群、耐熱大腸菌群和大腸埃希菌

1、細菌培養(yǎng)--平板培養(yǎng)劃線法培養(yǎng)涂布法培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)限制性內(nèi)切酶EcoRI內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶:一種在特殊核甘酸序列處水解雙鏈DNA的內(nèi)切酶。Ⅰ型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化,又催化非甲基化的DNA的水解;而Ⅱ型限制性內(nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的水解。分子剪刀沃納?阿爾伯1929年生于瑞士。蘇黎士工科大學畢業(yè)后,在日內(nèi)瓦大學獲得博士學位。1971年起,任巴塞爾大學教授。在研究噬菌體的遺傳現(xiàn)象時,成功地分離出DNA的限制性酶和甲基化修飾酶,為此獲1978年諾貝爾生理學醫(yī)學獎。限制—修飾現(xiàn)象Kλ(B)λ(B):能夠在大腸桿菌B菌株上生長的λ噬菌體第一次感染K菌株,形成的噬菌斑很少,生長受寄主限制Kλ(K)存活下來的噬菌體再次感染K菌株,則形成的噬菌斑很多,不受限制EO輛P:鍛Ef接fi幅ci亦en軌cyof場p椅la鈔ti鞭ng(生宅長在俊不同香寄主懷中的λ噬菌朵體的成斑支率,表家示限日制程泊度)說明K和B菌株熄中存莖在一廚種限劫制系風統(tǒng)可呀排除潛外來量的DN肉A;10-4的存追活率遭是由糧宿主臂限制授系統(tǒng)嶼作用向的結(jié)雁果產(chǎn)生政這種幸現(xiàn)象皂的原阻因何野在甲基僻化酶哭:能使麻細胞唐自身蔬核酸秋的內(nèi)桐切酶理識別圍序列番的堿濾基甲骨基化電,從獵而使粒自身詞核酸照免受構(gòu)內(nèi)切鹽酶水辱解——細菌塊的“努防御興”系唐統(tǒng)核酸羅內(nèi)切均酶:識別庭并水撞解外哭源DN啄A(外來革核酸宿在內(nèi)湖切酶他識別喘序列劑上沒葵有甲委基化度修飾心作保蘋護)研究置發(fā)現(xiàn)瓶:原礙來是溉由兩態(tài)種酶中配合弱完成浙,一訂種是廉起修冒飾作租用的骨甲基姑化酶寄,另家一種蜘是核猜酸內(nèi)胖切酶限制修飾限制—修飾雷體系Kλ(B)λ(K)λ(B):沾能夠夠在大敞腸桿雞菌B菌株恒上生妹長的λ噬菌炸體Kλ(K)再次奴感染K菌株告,則粗形成哭的噬錘菌斑號很多疫,不課受限興制(K菌株席已經(jīng)灑對其憲進行爸了修舒飾)λ(B)噬錦菌體夾感染瓶大腸度桿菌K菌株卻后,遠其DN萄A大部劍分被聚內(nèi)切隆酶降堆解了紗,但睛有極究少部叢分能鎮(zhèn)在特逆定序袍列甲逢基化鍛,避粗免被厘酶解繭,因困此有血少量源噬菌妥斑形滑成。在限托制修扶飾系精統(tǒng)中雀,限制吵作用是指潤一定雕類型執(zhí)的細鈴菌可兼以通撿過限霜制性餐酶的敲作用看,破紛壞入蛾侵的掉外源DN盜A(如戶噬菌安體DN字A等)斧,使斬得外陰源DN損A對生垃物細放胞的惕入侵星受到宗限制勵;而宿裙主細范胞自買身的DN創(chuàng)A分子虜合成遇后,作通過脊修飾嚇酶的山作用披:在裹堿基醋中特忠定的朗位置銹上發(fā)忘生了傭甲基泊化而副得到賠了修塞飾,爹可免載遭自癥身限游制性走酶的訴破壞賺,這朝就是戴限制先修飾尺系統(tǒng)林中修飾懼作用的含敏義。限制—修飾臘體系名,其功能就是對保護虹自身摘的DN瘡A,分腰解外汁來的DN勒A,以財保護刑和維陽持自小身遺材傳信悅息的氧穩(wěn)定破,這奏對細慌菌的意生存憂和繁墓衍具靠有重超要意鑄義。分類核酸外切酶核酸內(nèi)切酶核酸酶從核酸鏈的一端開始,一個接一個地消化降解核苷酸從核酸鏈分子內(nèi)部切割3’,5’磷酸二酯鍵,使之斷裂形成小片段核酸桑內(nèi)切司酶:按限誓制性爽酶的閱組成殲、限挽制和痛修飾瘋活性戀、切無斷核架酸的糞情況仁不同樂,分日三類門(I,II,II術(shù)I),通常永指的擴是II型。命名金法H違i袋nd閑II南I同一奪菌株即中所板含的俘多個脹不同鍬的限屑制性遠核酸墨內(nèi)切慣酶如從碼流感工嗜血桑桿菌d菌株讓(Ha戴em稈op僑hi亦l(xiāng)u例sin宣fl月ue龜nz盞aed)先油后發(fā)圈現(xiàn)3種限梢制性住酶,海則分肌別命甜名為Hi戰(zhàn)ndI,Hi山ndI某I,Hi洽ndI非II大腸桿菌R菌株REscherichia嗜血流感桿菌d株dinfflluenzaeHaemophiillus株名(型號)種名的頭兩個字母宿主屬名的第一個字母coli前3個字舒母代鐮表來狹源的畫生物隨后1個字居母或婆阿拉化伯數(shù)圖字代腐表菌竹株最后1個羅呈馬字孤母代害表發(fā)瓦現(xiàn)或少鑒定雀的次慰序基本址特征識別垮并切斯割雙宣鏈DN噴A(環(huán)冬狀或動線狀遺)分聲子中4-猴8b污p的特農(nóng)定序溪列結(jié)構(gòu)鑄特征弦:旋赤轉(zhuǎn)對吹稱的植回文迫結(jié)構(gòu)切割穩(wěn)后產(chǎn)煤生的基末端死:Co舍he賢si茫ve言t擦er住mi謙nu熄s鳥or突B譜lu站nt朋e倦nd(粘挽性末村端或黃平末驕端)Ec工oRI的識鵝別序狐列5’始…G獄C失TG漿A棒A室T競T主CG批A喚G姜…億3’3’宵…C蠟G線AC乓T亂T敬A屢A漁GC叛T藥C鋪…腎5’Ec袋oRI的切溫割位灣點質(zhì)粒質(zhì)粒流是一引種染色穩(wěn)體外的皂穩(wěn)定與遺傳固因子惹,大脂小從1~虛20和0k烤b不等遮,為醋雙鏈姓、閉合環(huán)的DN腫A分子,并頸以超螺客旋狀態(tài)勒存在暈于宿主掛細胞中。哲質(zhì)粒味主要月發(fā)現(xiàn)戰(zhàn)于細菌、放線雜菌和真菌細胞爐中,慘它具叛有自亡主復制和轉(zhuǎn)錄能力憂,能唯在子姻代細胞中保證持恒炕定的宵拷貝布數(shù),遞并表澆達所嘆攜帶撒的遺傳頸信息。質(zhì)崖粒的銹復制腥和轉(zhuǎn)劫錄要毯依賴阻于宿炒主細寧胞編逗碼的旗某些港酶和蛋白測質(zhì),如兩離開畏宿主禮細胞縣則不旬能存獨活,駕而宿主即使小沒有海它們臥也可零以正開常存神活。寫質(zhì)粒屈的存衰在使歲宿主偵具有避一些依額外艘的特距性,崗如對絕抗生墨素的呈抗性資等。萊德蒼伯格攤(19疲25握~2摔00準8),大美國耽遺傳倒學家豆。細菌謝遺傳熄學的鑒創(chuàng)始黑人之圣一。19吧25年5月23日生叼于美薄國蒙碧特克耐萊市庸。19線44年獲哥倫斯比亞捷大學學士洞學位抹,以唇后曾晚在醫(yī)敞學院坐學習薪,不彼久轉(zhuǎn)伴入耶魯犧大學,于19累47年獲笛博士界學位滿。19跟59年起螺任斯坦狂福醫(yī)助學院教授攻兼遺仁傳學崖系主槍任。19訴62年任??夏岢涞戏趾喿俞t(yī)毒學實撲驗室淡主任際。他在萌耶魯海大學恢期間殺,發(fā)撕現(xiàn)細菌免的遺妻傳重經(jīng)組。19萄46年,暢他和E.借L.塔特搞姆發(fā)現(xiàn)午遺傳盞重組鄉(xiāng)豐的普份遍性沙。19扛52年發(fā)恨現(xiàn)細暴菌的F因子。19思52年發(fā)乞現(xiàn)沙寧門氏蝦菌中尤的普擊遍性炭轉(zhuǎn)導央,19蠢53年發(fā)晃現(xiàn)大腸盟桿菌的溫母和噬相菌體λ在染蛾色體獲上占盈有一鞏定位尖置。19凱56年發(fā)底現(xiàn)λ噬菌爆體能渾進行逐局限偷性轉(zhuǎn)股導。維他們認的研彈究工做作還鉛包括猶應(yīng)用稀細菌順的有恥性生踢殖和恩轉(zhuǎn)導去進行腰細菌號的免牌疫學算和代貸謝作州用等傭方面憐的研至究。19頃58年他饞和G.跡W.比德蔬爾和E.箏L.塔特平姆共猾同獲斜得諾迅貝爾勢生理亮學或南醫(yī)學項獎。接合店現(xiàn)象避的發(fā)及現(xiàn)接合哀:指通饑過細纖菌細無胞的籮直接伯接觸接,遺幣傳物間質(zhì)從供體轉(zhuǎn)移全到受體并發(fā)都生重慕組的鍛過程系。19密46年萊德暗伯格和塔幻玉特姆發(fā)現(xiàn)抱了細菌吼的接協(xié)合。細菌拍的雜那交實毒例(19橋46)不同講營養(yǎng)單缺陷可型的西大腸販桿菌投(K1脅2):A菌株萬:me牙t-bi依o-th舞r+le怨u+th驗i+,B菌株洗:me荒t+bi圍o+th芽r-le渠u-th顫i-這種勤野生柔型細童胞如襲何出狼現(xiàn)的江?U型管溝實驗猛:A、B菌株份分別升培養(yǎng)磨在基越本培呈養(yǎng)基愉上一邊漏加壓堤和吸襪引使瀉培養(yǎng)藥液充要分混榜合結(jié)果蠶任何雀一臂爭的培辟養(yǎng)基流上均拖未長慘出野景生型書細菌莊。結(jié)論攜:菌咱株A與菌褲株B細胞乘直接墓接觸貿(mào)(接閑合)頂是野谷生型毫細胞兵出現(xiàn)弄的必夢要條立件;昌兩菌布株直辮接接餓觸后枯導致撇遺傳同物質(zhì)伯轉(zhuǎn)移乒,進醫(yī)而發(fā)贈生基魔因重票組,社產(chǎn)生乳野生漸型細列菌。試驗金證明堪:接合溫過程者是一很種單向致轉(zhuǎn)移,A菌株混遺傳煤物質(zhì)B菌株勞,從釘供體蹲到受督體。用大糖腸桿卡菌K1嗽2的菌放株A和菌牲株B,首藝先用些高劑祝量的鏈霉庫素處理宏菌株A或菌鉆株B,把儉處理妻過的鴉菌株A跟未棕處理腫過的予菌株B混合知,或突把處掙理過掀的菌殃株B跟未累處理畝過的柳菌株A混合高,發(fā)準現(xiàn)結(jié)嶼果大途不相余同:⑴們F因子肉:致繞育因飼子或援稱性肚因子蠶,是越一種括附加襲體。攜帶F因子贊的菌簡株稱接為供粒體菌孤或雄肚性,植用F+表示智。未攜茂帶F因子疾的菌問株為掃受體勢菌或永雌性胃,用F-表示和。F因子倦及F+向F-的轉(zhuǎn)萬移⑵結(jié)F因子克的結(jié)哪構(gòu)染色角體外幣遺傳紛物質(zhì)厘(質(zhì)俊粒)栽,環(huán)叢狀DN所A,9×1彩04bp,大倚約為妄大腸救桿菌依環(huán)狀共染色礎(chǔ)體的2%,具廟有40潮~6陡0個蛋暈白質(zhì)丸基因筑。每個不細胞嫩(F+)有2~加4個。F因子淡分為洗三個傍區(qū)域揪:自主勇復制腿區(qū):有郵轉(zhuǎn)移括的起查點和2個復比制起碗點。雜復制購起點Or趨iT是在鞋染色納體轉(zhuǎn)歷移時乏進行滾環(huán)劈燕復制時的浪復制寸起點桌;Or項iV是在儲營養(yǎng)扮時期殃,即恭游離侵在細光胞質(zhì)媽中獨立伴復制時的姜復制率起點喬。轉(zhuǎn)移崇區(qū):主陡要有唱合成性傘蠶毛即F纖毛(Fpi盯li)的檔操縱榨子。F纖毛革是由判性傘毛械蛋白危構(gòu)成悄,呈很管狀罷,又誼叫接魔合管童。通創(chuàng)過接境合管別可將堤供體經(jīng)和受削體細炒胞相糟聯(lián)。乎共30峰kb長,就有40個基楊因與DN顧A的轉(zhuǎn)毛移有椒關(guān)。重組嚴區(qū):有4個插急入順兄序(IS),乘通過脖和宿脅主染志色體上的IS同源雁重組滅或通曾過轉(zhuǎn)葵座,F(xiàn)因子虎可以室整合劍到宿路主不守同位濫點上臣。⑶種F因子或的三場種狀令態(tài)②有一窗個自陳主狀緞態(tài)的F因子裹,即F+細胞睡;③帶有烏一個悶整合自的F因子藝的細毛胞叫高頻蔑重組凱細胞,Hf絨r細胞破。①沒有F因子奇,即F-細胞毀;F+與F-菌(1)有F因子連的細昂菌稱戰(zhàn)為F+,細惡菌增筐殖時宣可把F因子子傳遞趕給后撓代細駝胞(禮通過死自主青復制顛)。(2)沒仁有F因子煉的細對菌稱遭為F-,F(xiàn)+細菌辟經(jīng)吖模啶橙處稅理而下丟失搬,成租為F-。F因子爛一經(jīng)叨丟失榆,細胞攀中便飛不再執(zhí)出現(xiàn)販;(3)F+可以非和F-雜交鞭,而裝不能娘和F+雜交壩;(4)F+菌與F-菌混喚合(膜即F+×F-)1小時希后,敬約95奪%的F-菌轉(zhuǎn)息變?yōu)镕+菌,頭而原窮來的F+仍然憲保留裁有F因子垮。(1剃)堆F纖毛時合成輝:由性傘肯毛蛋硬白構(gòu)成派,接合提管使供值體和蹤蝶受體垃細胞拳接觸肺。(2過)轉(zhuǎn)移總啟動負:F因子驗從轉(zhuǎn)煩移復修制起征點(Or專iT)開始沙向F-轉(zhuǎn)移優(yōu)(5’端首舟先進吸入受傭體)。(3租)單鏈萬轉(zhuǎn)移否,滾胸環(huán)復砍制。F纖毛旱與接砍合管F+×F-Hf此r是F因子霸整合世到E.繁co烈li染色隔體上拾的結(jié)投果E.執(zhí)co童li染色宗體上堡有20個以盾上的助整合叛位點為;整合懼通過IS等同夸源重甩組或勁轉(zhuǎn)座績實現(xiàn)滑;F因子脊有多唱個整挖合位救點,滋主要甚在IS郊3處。分子拌克隆pU沖C1革8pU集C1帳9含四訂個部微分:(1)來澆自pB屈R3扎22的質(zhì)靜粒復杠制起主點(or厘i);(2)am跳pr;(3)大蜜腸桿率菌β半乳枯糖苷熄酶基考因(la竭cZ’)的新啟動雀子及章其編沙碼α-肽鏈笛的DN澇A序列定;(4)多運克隆暈位點遲(MC挖S)la運cZ`Or供iAm駕prMC技S藍白寨斑篩儀選重寺組子攻的原鐘理:la胳cZ’編碼β半乳授糖苷境酶的α肽,鳳在異勤丙基擦硫代-凱β-貼D-半乳元糖苷聞(IP恐TG)的那誘導熟下,拔使呈希色底草物5-溴-4騎-氯-3辰-吲哚-幫β-窮D-半乳招糖苷掘(X-盞ga元l)被挨分解另產(chǎn)生剝藍色選。因熔此攜慶帶空文載體軍的大主腸桿售菌呈恩藍色蒼菌落灣。外源倦基因妥的插濕入使α肽失北活,林因而慢攜帶臨外源陳基因用的重哄組子此菌落域呈白線色。利用迷菌落形顏色淺篩選景重組詢子PU限C質(zhì)粒診

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