分子發(fā)光光譜法課件

分子發(fā)光光譜法分子發(fā)光光譜法分子發(fā)光光譜法某些物質(zhì)的分子吸收一定能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，以光輻射的形式從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，這種現(xiàn)象稱為分子發(fā)光，在此基礎(chǔ)上建立起來的分析方法為分子發(fā)光分析法。分子在退激過程中以光輻射形式釋放能量§5.1概述一、分子發(fā)光分析法及其分類2021/2/42某些物質(zhì)的分子吸收一定能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，以光輻射的形式從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，這種現(xiàn)象稱為分子發(fā)光，在此基礎(chǔ)上建立起來的分析方法為分子發(fā)光分析法。較高激發(fā)態(tài)基態(tài)吸收能量受激光輻射退激分子在退激過程中以光輻射形式釋放能量§5.1概述一、分子發(fā)光分析法及其分類2021/2/42根據(jù)分子受激時所吸收能源及輻射光的機(jī)理不同分為以下幾類：光致發(fā)光：以光源來激發(fā)而發(fā)光化學(xué)發(fā)光：以化學(xué)反應(yīng)能激發(fā)而發(fā)光—化學(xué)發(fā)光分析法電致發(fā)光：以電能來激發(fā)而發(fā)光—原子發(fā)射光譜法生物發(fā)光：以生物體釋放的能量激發(fā)而發(fā)光熒光—熒光分析法磷光—磷光分析法2021/2/43二、分子熒光分析法的特點1.靈敏度高熒光強度隨激發(fā)光強度增強而增強（提高激發(fā)光強度，可提高熒光強度采用高靈敏度的檢測系統(tǒng)可大大提高靈敏度，檢測限熒光分析法比分光光度法低2~4個數(shù)量級激發(fā)發(fā)射熒光強強激發(fā)光物質(zhì)2021/2/442.選擇性好不同的物質(zhì)用不同的光進(jìn)行激發(fā)，選擇不同的激發(fā)光波長不同的物質(zhì)發(fā)射的熒光不同，選擇不同的檢測熒光波長比較容易排除其它物質(zhì)的干擾，選擇性好3.實驗方法簡單4.待測樣品用量少；儀器價格適中；測定范圍較廣具發(fā)光強度可定量測定許多痕量的無機(jī)物和有機(jī)物，廣泛應(yīng)用在生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)及農(nóng)牧產(chǎn)品分析、衛(wèi)生檢疫等領(lǐng)域。熒光法比磷光法應(yīng)用廣泛，不如分光光度法2021/2/45§5.2分子熒光和磷光的基本原理一、熒光和磷光的產(chǎn)生激發(fā)態(tài)分子在躍遷回到基態(tài)的過程中將多余的能量以光子形式輻射出來，這種現(xiàn)象稱為“發(fā)光”激發(fā)單重態(tài)：分子吸收能量后，在躍遷過程中不發(fā)生自旋方向的變化。用S0、S1、S2分別表示分子的基態(tài)、第一和第二激發(fā)單重態(tài)。2021/2/46激發(fā)三重態(tài)：分子吸收能量后，在躍遷過程中伴隨著電子自旋方向的變化。用T1、T2分別表示分子第一和第二激發(fā)三重態(tài)。2021/2/471.振動弛豫:它是指在同一電子能級上，電子由高振動能級轉(zhuǎn)移至低振動能級的無輻射躍遷過程。2.內(nèi)轉(zhuǎn)換:是指兩個電子能級非?？拷灾缕湔駝幽芗売兄丿B時，常發(fā)生電子由高能級轉(zhuǎn)移至低能級的無輻射躍迂過程。3.系間跨越:不同多重態(tài)間的無輻射躍遷，同時伴隨著受激電子自旋狀態(tài)的改變，如S1→T1。4.外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子通過與溶劑或其他溶質(zhì)分子間的相互作用使能量轉(zhuǎn)換，而使熒光或磷光強度減弱或消失的過程。這一現(xiàn)象又稱為“熄滅”或“淬滅”。2021/2/48S0S0S1S2T1λ2吸光內(nèi)轉(zhuǎn)換系間跨躍λ1吸光λ3熒光外轉(zhuǎn)換λ4磷光振動馳豫2021/2/49熒光發(fā)射：當(dāng)分子處在單重態(tài)的最低振動能層時，去激發(fā)過程是以10-7～10-9s左右的時間內(nèi)發(fā)射一個光子回到基態(tài)。磷光發(fā)射：激發(fā)態(tài)分子經(jīng)過系間跨躍到激發(fā)三重態(tài)后，并經(jīng)過迅速的振動馳豫到達(dá)第一激發(fā)三重態(tài)（T1）的最低振動能級上，從T1態(tài)分子經(jīng)發(fā)射光子返回基態(tài)。磷光的壽命比熒光的要長得多2021/2/410從圖中看出磷＞熒＞

激*易產(chǎn)生熒光

n*易產(chǎn)生磷光2021/2/411二、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜固定熒光的最大發(fā)射波長，然后改變激發(fā)光的波長，根據(jù)所測得的熒光強度與激發(fā)光波長的關(guān)系作圖，得到激發(fā)光譜曲線。選擇最大激發(fā)波長作為激發(fā)光波長，然后測定不同發(fā)射波長時所發(fā)射的熒光或磷光強度，得到熒光或磷光光譜曲線。2021/2/4122021/2/413三、分子熒光參數(shù)1．量子產(chǎn)率又稱熒光效率物質(zhì)分子的熒光產(chǎn)率必然由激發(fā)態(tài)分子之活化過程的各個相對速率決定：2021/2/4142．熒光壽命熒光壽命是指停止激發(fā)之后，熒光強度降到最大強度的1/e所需要的時間，常用τ表示。I0，It分別表示在時間0和t時的熒光強度。利用熒光壽命，可以進(jìn)行熒光混合物分析。2021/2/415物質(zhì)只有吸收了紫外可見光，產(chǎn)生*n*躍遷，產(chǎn)生熒光*與n*躍遷相比，摩爾吸收系數(shù)大，壽命短*躍遷常產(chǎn)生較強的熒光，n*躍遷產(chǎn)生的熒光弱，但可產(chǎn)生系間竄躍，產(chǎn)生更強的磷光一般情況，有機(jī)芳香族化合物及金屬離子配合物是最強最有用的熒光體三、熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系2021/2/416具有共軛體系的芳環(huán)或雜環(huán)化合物，電子共軛程度越大，越易產(chǎn)生熒光;環(huán)越多，共軛程度越大，產(chǎn)生熒光波長越長，發(fā)射的熒光強度越強fex/nm

em/nm0.112052780.292863100.46365400苯萘蒽350菲線狀環(huán)結(jié)構(gòu)比非線狀結(jié)構(gòu)的熒光波長長1.共軛體系——有較強的熒光2021/2/417芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)生熒光多環(huán)芳烴是重要的環(huán)境污染物，可用熒光法測定3，4-苯并芘是強致癌物ex=386nm

em=430nm2021/2/4182.剛性平面結(jié)構(gòu)———較穩(wěn)定的平面結(jié)構(gòu)具有強熒光的分子多數(shù)有剛性平面結(jié)構(gòu)熒光素：氧橋把兩個環(huán)固定在一個平面上，具有平面結(jié)構(gòu)，強熒光物質(zhì)酚酞：無氧橋把兩個環(huán)固定，不能很好的共平面，為非熒光物質(zhì)2021/2/419例1，2-二苯乙烯反式：平面構(gòu)型強熒光體順式：非平面構(gòu)型非熒光體2021/2/4203.金屬螯合物的熒光大多數(shù)無機(jī)鹽類金屬離子，不能產(chǎn)生熒光，但某些螯合物都能產(chǎn)生很強的熒光，可用于痕量金屬離子的測定不少有機(jī)配體是弱熒光體或不發(fā)熒光，但與Mn+形成螯合物后變?yōu)槠矫鏄?gòu)型，就會使熒光加強或產(chǎn)生熒光例：8-羥基喹啉為弱熒光體，與Mn+—Al3+、Mg2+形成螯合物后，能形成剛性結(jié)構(gòu)，熒光加強2021/2/4214.取代基的類型對熒光物質(zhì)的熒光特征和強度也有很大影響。分成三類：（1）增強熒光的取代基——有-OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等給電子基團(tuán)由于基團(tuán)的n電子（孤對電子）的電子云與苯環(huán)上的

軌道平行，共享了共軛電子，擴(kuò)大了共軛體系，使熒光波長長移，熒光強度增強2021/2/422（2）減弱熒光的取代基

——-COOH、-NO2、-COOR、-NO、-SH吸電子基團(tuán),使熒光波長短移，熒光強度減弱（3）影響不明顯的取代基——-NH3+、-R、-SO3H等(4)芳環(huán)上被F、Cl、Br、I取代后，使系間竄躍加強，磷光增強，熒光減弱。其熒光強度隨鹵素原子量增加而減弱，磷光相應(yīng)增強，這種效應(yīng)為重原子效應(yīng)。(5)取代基位置——對位、鄰位取代增強熒光，間位取代抑制熒光。2021/2/423四、環(huán)境對熒光、磷光的影響1.溶劑的影響

同一熒光物質(zhì)在不同的溶劑中可能表現(xiàn)出不同的熒光性質(zhì)，一般來說，溶劑的極性增強，熒光波長長移，熒光強度增大2.溫度的影響——低溫下測定，提高靈敏度因為輻射躍遷的速率基本不隨溫度變，而非輻射躍遷隨溫度升高顯著增大。大多數(shù)熒光物質(zhì)都隨溶液溫度升高熒光效率下降，熒光強度減弱。溫度對磷光影響更大2021/2/4243.pH的影響大多數(shù)含有酸性或堿性基團(tuán)的芳香族化合物的熒光性質(zhì)受溶液pH的影響很大。共軛酸堿對是具有不同熒光性質(zhì)的兩種型體，具有各自的熒光效率和熒光波長。例：苯酚離子化后，熒光消失pH≈1有熒光pH≈13無熒光2021/2/425但兩個苯環(huán)相連的化合物，又表現(xiàn)出相反的性質(zhì)，分子形式無熒光，離子化后顯熒光例：—苯酚有熒光無熒光另外，表面活性劑也會影響熒光強度和特性。2021/2/4264.熒光猝滅（熒光熄滅）——熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強度降低的現(xiàn)象。使熒光強度降低的物質(zhì)稱為熒光猝滅劑(i)碰撞熄滅碰撞熄滅是熒光熄滅的主要原因。它是指處于激發(fā)單重態(tài)的熒光分子M*與熄滅劑Q相互碰撞后，激發(fā)態(tài)分子以無輻射躍遷的方式返回基態(tài)，產(chǎn)生熄滅作用。碰撞熄滅將隨溫度的升高而增加；將隨溶液黏度的減小而增大。2021/2/427（ⅱ）能量轉(zhuǎn)移它是指處于激發(fā)單重態(tài)的熒光分子M*與熄滅劑相互作用后，發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，使熄滅劑得到激發(fā)，其反應(yīng)如下(ⅲ)組成化合物的熄滅它是指熄滅劑和熒光分子在基態(tài)時發(fā)生配合反應(yīng)，生成不發(fā)熒光的配合物。2021/2/428(ⅳ)自熄滅和自吸收當(dāng)熒光物質(zhì)濃度較大時，常會發(fā)生自熄滅現(xiàn)象，這可能由于激發(fā)態(tài)分子之間的碰撞引起能量損失。假如熒光物質(zhì)的吸收光譜和發(fā)射光譜有較大的重疊，由熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光，有一部分可能會被它自身的基態(tài)分子所吸收，這種現(xiàn)象稱為自吸收。隨熒光物質(zhì)濃度的增加，自吸收現(xiàn)象將會加劇。2021/2/429五、熒光強度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系用強度為I0的入射光，照射到液池內(nèi)的熒光物質(zhì)時，產(chǎn)生熒光，熒光強度If用儀器測得，在熒光濃度很稀(A<0.05)時，熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光強度If與濃度有下面的關(guān)系If=fIa=f（I0-I）Ia為吸收的輻射強度I0為入射光強度熒光池I0IIf熒光強度檢測器If=f（I0-I010-A）=fI0

（1-10-A）I=I010-A將上式展開2021/2/430當(dāng)A﹤0.05時，方括號中其它各項與第一項相比可忽略不計，上式簡化If=2.3fI0A=2.3fI0bc當(dāng)A﹤0.05時，If與f、I0、和c有關(guān)，對一給定物質(zhì)，當(dāng)激發(fā)光波長和強度一定時，f、I0、和b為常數(shù)，合并為K

If=KCIp=KC定量分析依據(jù)2021/2/431熒光強度與物質(zhì)濃度呈線形關(guān)系，If=KC只有在濃度低時使用，熒光物質(zhì)測定的是微量或痕量組分，靈敏度高。濃度高時，If與C不呈線形關(guān)系，有時C增大，If反而降低因為公式[]中后面影響，有時發(fā)生熒光猝滅效應(yīng)。2021/2/432（一）熒光分析儀器——主要由光源、單色器、液槽、檢測器和顯示器組成光源第一單色器液池第二單色器檢測器放大器及記錄器exem與分光光度計有兩點不同①兩個單色器②檢測器與激發(fā)光互成直角I0§5.3熒光和磷光分析儀2021/2/4331、光源激發(fā)光源一般要求比吸收測量中的光源有更大的發(fā)射強度；適用波長范圍寬熒光光度計中常用高壓汞燈和氙弧燈利用汞蒸氣放電發(fā)光的光源；常用其發(fā)射365nm、405nm、436nm三條譜線以365nm的譜線最強應(yīng)用最廣泛的一種光源，可發(fā)射250~800nm很強的連續(xù)光源2021/2/4342、單色器大多數(shù)熒光光度計一般采用兩個光柵單色器，有較高的分辨率，能掃描圖譜，既可獲得激發(fā)光譜，又可獲得熒光光譜第一單色器作用：分離出所需要的激發(fā)光，選擇最佳激發(fā)波長ex，用此激發(fā)光激發(fā)液池內(nèi)的熒光物質(zhì)ex。第二單色器作用：濾掉一些雜散光和雜質(zhì)所發(fā)射的干擾光，用來選擇測定用的熒光波長em。在選定的em下測定熒光強度，定量分析。2021/2/4353、樣品池盛放測定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上邊。4、檢測器把光信號轉(zhuǎn)化成電信號,放大,直接轉(zhuǎn)成熒光強度熒光的強度一般較弱，要求檢測器有較高的靈敏度，熒光光度計采用光電倍增管。熒光分析比吸收光度法具有高得多的靈敏度，是因為熒光強度與激發(fā)光強度成正比，提高激發(fā)光強度可大大提高熒光強度2021/2/436（二）磷光分析儀器與熒光分析儀器相似，主要差異如下：1.試樣室試樣需在液氮溫度（77K，-196℃）下測定低溫磷光（將液池放在盛放液氮的杜瓦瓶內(nèi)）固體表面室溫磷光分析需特制試樣室2.磷光鏡有些物質(zhì)既可產(chǎn)生熒光，又能產(chǎn)生磷光。用機(jī)械切光裝置——磷光鏡區(qū)別熒光和磷光。利用熒光壽命短，磷光壽命長消除熒光干擾。2021/2/437（一）定量分析方法定量分析依據(jù)If=KCIp=KC1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法——最常用的定量分析方法將已知量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與試樣在相同條件下處理，配制一系列標(biāo)準(zhǔn)液，測定它們的相對發(fā)光強度。以相對熒光強度為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)§5.4熒光和磷光分析及其應(yīng)用2021/2/4382.熒光猝滅法把熒光猝滅用在定量分析上，具有較高的靈敏度和選擇性若熒光物質(zhì)M與猝滅劑Q生成不發(fā)熒光的基態(tài)配合物MQM+Q=MQ（非熒光物質(zhì)）經(jīng)推導(dǎo)得出：猝滅劑加入前的熒光強度猝滅劑加入后試液的熒光強度常數(shù)猝滅劑濃度I前/I后與C（Q）有線性關(guān)系，可求猝滅劑含量2021/2/439與標(biāo)準(zhǔn)曲線法相似，對一定濃度的熒光體系，分別加入一系列不同量的猝滅劑Q，配成一個熒光物質(zhì)—猝滅劑體系，然后在相同條件下測定它們的熒光強度，得一曲線取相同熒光物質(zhì)CMCMCMCM

…

CM加不同量QCQ0CQ1CQ2CQ3…

CQx(CQ0=0)

測IfI前I后1I后2I后3

…I后

x計算I前/I后I前/I后1I前/I后2I前/I后3

…

I前/I后x

CQxCQI前/I后xI前/I后2021/2/4403.比較法——比較簡單如果試樣數(shù)量不多，可用比較法進(jìn)行測量配一標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為Cs，Cs與未知液濃度Cx相近，并在相同條件下測定它們的熒光強度未知液If

x=KCx標(biāo)準(zhǔn)液If

s=KCs比較2021/2/4414.多組分混合物的熒光分析(1)如果兩組分的熒光峰相互不干擾,可直接測定可分別在各自的熒波長處測定,求出它們的含量(2)如果兩組分的熒光峰相互干擾,但激發(fā)光譜有顯著區(qū)別,在某一激發(fā)光下一個組分產(chǎn)生熒光峰,另一組分不產(chǎn)生熒光;可選用不同的激發(fā)光進(jìn)行測定2021/2/442Al3+—8-羥基喹啉配合物的氯仿溶液

ex=365nm

em=520nmGa3+—8-羥基喹啉配合物的氯仿溶液

ex=436nm

em=520nm365nm激發(fā)光，Al3+的配合物產(chǎn)生熒光，而Ga3+配合物不產(chǎn)生熒光，無熒光峰；436nm激發(fā)光，Ga3+的配合物產(chǎn)生熒光，而Al3+配合物不產(chǎn)生熒光，無熒光峰在365nm條件下激發(fā)，520nm處測Al3+—8-羥基喹啉配合物，在436nm條件下激發(fā)，520nm處測Ga3+—8-羥基喹啉配合物例：2021/2/443(3)如果兩組分的熒光光譜和激發(fā)光譜相互干擾利用熒光強度的加和性（F=F1+F2+F3+…），在適宜的熒光波長處測定，用聯(lián)立方程來求解例：硫胺熒CT

ex=385nm

em=435nm

吡啶硫胺熒CP

ex=410nm

em=480nm相互干擾熒光光譜重疊在385或410nm下激發(fā)，在435和480nm下分別測熒光強度2021/2/444在385或410nm下激發(fā)，在435和480nm下分別測熒光強度If435/385=26339104CT+210104CPIf480/385=9685104CT+1022104CPIf480/410=2816104CT+1709104CPIf435/410=6419104CT+252104CP硫胺素濃度吡啶硫胺素濃度If=KC——K:純物質(zhì)在選定波長下測If,求K385nm激發(fā)或410nm激發(fā)2021/2/445（二）熒光分析法的應(yīng)用熒光分析法具有靈敏度高、取樣量少等優(yōu)點1.無機(jī)化合物的分析無機(jī)化合物中，能直接產(chǎn)生熒光并應(yīng)用于測定的為數(shù)不多，但與有機(jī)化合物生成發(fā)熒光的有機(jī)配合物后，進(jìn)行熒光分析的元素達(dá)70多種，其中較常采用熒光法測定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀土元素能夠同金屬離子形成熒光配合物的有機(jī)試劑絕大多數(shù)是芳香族化合物，形成五元環(huán)或六元環(huán)的螯合物，分子的剛性平面結(jié)構(gòu)增大，變?yōu)閺姛晒怏w熒光猝滅法也是熒光分析中經(jīng)常采用的方法?？刹捎脽晒忖绶ㄩg接測定的離子有：F-、S2-、Co2+、Ni2+、Cu2+等2021/2/4462.有機(jī)化合物的分析脂肪族有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)較為簡單，本身能發(fā)熒光的很少，一般需要與某些試劑反應(yīng)后才能進(jìn)行熒光分析芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)熒光；可直接用熒光法測定。對于具有致癌活性的多環(huán)芳烴——熒光分析法是最主要的測定方法2021/2/447為提高測定的靈敏度，有時也將芳香族化合物與適當(dāng)試劑反應(yīng)之后進(jìn)行測定可測定結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大量有機(jī)物質(zhì)，如：各種維生素、葉綠素、氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和輔酶以及各種藥物、毒物和農(nóng)藥等2021/2/448例：3，4–苯并芘3，4–苯并芘為強致癌物質(zhì)煤炭、石油、天然氣等燃料不完全燃燒以及吸煙、焚燒垃圾都會產(chǎn)生3，4–苯并芘，汽車尾氣也是主要來源食品加工過程也會產(chǎn)生3，4–苯并芘，尤其是煙熏、油炸、烘烤食品分析測定：用環(huán)己烷將3，4–苯并芘從試樣中提取出來，用堿將提取液的脂肪類物質(zhì)皂化，然后用色譜法分離純化，用95%C2H5OH稀釋，用熒光分光光度計測定相對熒光強度進(jìn)行定量2021/2/449例：VB2——又稱核黃素，是一種生長促進(jìn)劑，常存在于動物肝臟、肉類、蛋黃、豆類、花生、蘑菇和海藻中，VB2易溶于強酸或強堿性溶液。在低濃度情況下，I=KC，I與C呈線性關(guān)系，在pH6~7熒光最強在430~440nm藍(lán)光照射下，發(fā)出綠色熒光，em=535nm下測I，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定缺VB2會得口角炎、舌炎、唇炎、脂溢性皮維生素B22021/2/450（三）磷光分析法應(yīng)用能產(chǎn)生磷光的物質(zhì)數(shù)量很少，磷光分析不及熒光分析普遍，但磷光分析法已在藥物分析、臨床及環(huán)境分析領(lǐng)域得到一定的應(yīng)用。低溫磷光分析已應(yīng)用在萘、蒽、菲、芘、苯并芘等多環(huán)芳烴及含O、S、N的雜環(huán)化合物分析固體表面室溫磷光分析法已成為多環(huán)芳烴和雜環(huán)化合物的快速、靈敏的分析手段。2021/2/451§5.5化學(xué)發(fā)光分析法一、概述化學(xué)發(fā)光是利用化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的能量，使其中一種產(chǎn)物的分子的電子被激發(fā)成激發(fā)態(tài)分子，當(dāng)其返回基態(tài)時發(fā)射一定波長的光而建立的分析方法?；瘜W(xué)發(fā)光與熒光的主要區(qū)別：受激發(fā)時所需的能量來源不同，需要化學(xué)反應(yīng)過程中所提供的化學(xué)能2021/2/452化學(xué)發(fā)光分析具有以下特點靈敏度高——例：用熒光素酶和三磷酸腺苷ATP的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可測定低至2×10-17mol·L-1ATP線性范圍寬——一般有5~6個數(shù)量級儀器設(shè)備簡單，成本低廉分析速度快，易實現(xiàn)自動化局限性：可供發(fā)光用的試劑有限發(fā)光機(jī)理有待進(jìn)一步研究2021/2/453二、化學(xué)發(fā)光分析的基本原理（一）化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的基本條件發(fā)光反應(yīng)必須滿足以下條件1.化學(xué)反應(yīng)必須產(chǎn)生足夠的化學(xué)能化學(xué)發(fā)光基于化學(xué)反應(yīng)提供足夠的能量。在可見光區(qū)觀察化學(xué)發(fā)光，需170~300kJ·mol-1激發(fā)能，具有過氧化物中間產(chǎn)物的氧化還原反應(yīng)可滿足要求，化學(xué)反應(yīng)多是在有O3、H2O2等參加的高能反應(yīng)中。2.處于激發(fā)態(tài)分子能夠以輻射躍遷的方式返回基態(tài)。2021/2/454（二）化學(xué)發(fā)光效率和發(fā)光強度化學(xué)發(fā)光效率CL激發(fā)態(tài)分子的化學(xué)效率激發(fā)態(tài)分子的發(fā)光效率r取決于發(fā)光所依據(jù)的化學(xué)反應(yīng)本身f與熒光效率的影響因素相同，既取決于發(fā)光體本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，也受環(huán)境的影響2021/2/455化學(xué)發(fā)光強度具有高效率的化學(xué)發(fā)光是生物體中亦稱生物發(fā)光。如：螢火蟲發(fā)光反應(yīng)的效率幾乎接近100%。非生物體的化學(xué)發(fā)光效率一般不超過1%化學(xué)發(fā)光強度ICL（t）與反應(yīng)速度、化學(xué)發(fā)光效率有如下關(guān)系對下列化學(xué)發(fā)光反應(yīng)A+B→C*+D

C+hICL隨時間和反應(yīng)物消耗的變化逐漸減小2021/2/456A+B→C*+DA為待測物質(zhì)，C為發(fā)光物質(zhì)，當(dāng)反應(yīng)物B的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量于待測物濃度時，B的濃度可認(rèn)為是常數(shù)。因此，發(fā)光反應(yīng)可視為一級反應(yīng)t時刻的發(fā)光強度與該時刻的分析物濃度成正比化學(xué)發(fā)光總強度與分析物濃度呈線性關(guān)系。常用發(fā)光總強度來定量分析發(fā)光總強度2021/2/457三、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類型1.液相化學(xué)發(fā)光——研究和應(yīng)用的比較廣泛的有魯米諾（Luminol）光澤精、沒食子酸、洛粉堿、過氧草酸鹽等。魯米諾是最常用的發(fā)光試劑，它可以測定Cl2、HOCl、OCl-、H2O2、O2和NO2，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)時量子效率為0.01~0.05魯米諾（3–氨基苯二甲酰環(huán)肼）在堿性溶液中和H2O2等氧化劑反應(yīng)生成最大波長為425nm的光輻射2021/2/458氧化劑425nm反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)能被產(chǎn)物氨基鄰苯二甲酸根吸收，處于激發(fā)狀態(tài)，返回基態(tài)時發(fā)射熒光可檢測低至10-9mol·L-1的H2O22021/2/459魯米諾H2O2的化學(xué)反應(yīng)，可以被一些痕量的過渡金屬元素所催化，使發(fā)出的光大大增強，由此可測定Co（Ⅱ）,Cu（Ⅱ）,Ni（Ⅱ）,Cr（Ⅲ）