比色法和分光光度法

§16-1概述。§16-2光吸收的基本定律。§16-3比色法和分光光度法及其儀器§16-4顯色反應(yīng)與顯色條件的選擇。§16-5分光光度法儀器測量誤差及其消除§16-6分光光度法的某些應(yīng)用。

教學(xué)內(nèi)容第十六章比色法和分光光度法1化學(xué)分析法酸堿滴定法配位滴定法氧化還原滴定法沉淀滴定法重量分析法容量分析法儀器分析－－比色法和分光光度法2利用溶液顏色的深淺來測定溶液中有色物質(zhì)的濃度，這種測定方法稱為比色分析法。用分光光度計進(jìn)行的比色分析的方法稱為分光光度法?！?6-1概述目視比色,稱為比色法。3

—靈敏度高：測定下限可達(dá)10－5～10－6mol/L,10-4%～10-5%準(zhǔn)確度高一般吸光光度法的相對誤差為2-5%，對微量成分來說，還是比較滿意的，因為在這種情況下，滴定分析法和重量法也不夠準(zhǔn)確了，甚至無法進(jìn)行測定。操作簡便快速應(yīng)用廣泛:幾乎所有的無機(jī)離子和有機(jī)化合物都可直接或間接地用吸光光度法進(jìn)行測定。16-1-1光度分析法的特點

41、光的基本性質(zhì)

光具有波粒二象性，即波動性、粒子性。根據(jù)波長的不同，可分為：p396

紫外光區(qū)：200nm～400nm

可見光區(qū)：400nm～750nm

紅外光區(qū)：750nm～1000μm描述其波動性的主要參數(shù)是：波長λ，頻率γ

，光速C。三者間關(guān)系為：λγ＝C16-1-2物質(zhì)對光的選擇性吸收5具有同一波長的光稱為單色光。光的粒子性：如光電效應(yīng)。光子的能量（E）決定于光的頻率和波長：不同波長組成的光稱為復(fù)合光。白光（如日光）是復(fù)合光，是由紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫等光按適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度比例混合而成的，在400nm～750nm范圍的一種復(fù)合光。62、物質(zhì)對光的選擇性吸收物質(zhì)為什么有顏色，其實質(zhì)是什么？--物質(zhì)本性、光7互補(bǔ)色光如KMnO4吸收綠色光，因此KMnO4溶液呈現(xiàn)紫色。物質(zhì)的顏色8

將不同波長的光透過某一固定的溶液，測量不同波長下溶液對光的吸光度，作圖得到光吸收曲線,描述物質(zhì)對不同波長光的吸收。400480560640720λnm0.40.81.21.6AKMnO4溶液的吸收曲線DCBA

A、B、C、D代表不同濃度下的吸收曲線。3吸收曲線λmax9IrIoItIa

一束平行單色光照射透明溶液時，光的一部分被吸收，一部分透過溶液，一部分被器皿的表面反射。16-2-1朗伯-比爾定律§16-2光吸收的基本定律1、朗伯—比爾定律10Io=Ia

+It+Ir

若入射光強(qiáng)度為Io，吸收光的強(qiáng)度為Ia，透過光強(qiáng)度為It，反射光的強(qiáng)度為Ir，它們的關(guān)系是：

在吸光光度法中，測定時都是采用同樣質(zhì)量的比色皿，反射光的強(qiáng)度基本上是不變的，其影響可以相互抵消?？瞻渍{(diào)零。分光光度法中：

Io=Ia

+It11從上式可以看出：

溶液的透光度愈大，說明溶液對光的吸收愈小，相反，透光度愈小，說明溶液對光的吸收愈大.透光度:透過光強(qiáng)度It與入射光強(qiáng)度Io之比,用

T表示吸光度：用A表示12比例常數(shù)，與、c、T有關(guān)。b：溶液厚度朗伯定律：當(dāng)、c、T一定時，溶液的吸光度與液層的厚度成正比。比爾定律：當(dāng)、b和T一定時，溶液的吸光度與溶液的濃度成正比。13

朗伯—比爾定律（同時考慮溶液濃度和液層厚度的影響）一束平行單色光通過溶液，當(dāng)和T一定時，其吸光度與溶液的濃度和液層厚度成正比。朗伯-比爾定律的適用條件(1)單色光:應(yīng)選用max處或肩峰處測定(2)吸光質(zhì)點形式不變：離解、絡(luò)合、締合會破壞線性關(guān)系，應(yīng)控制條件(酸度、濃度、介質(zhì)等)(3)稀溶液：濃度增大，分子之間作用增強(qiáng)14

當(dāng)c用g·L-1表示，b用cm表示時，K用a表示，稱為吸光系數(shù)，其單位為

L·(g.cm)-1

，則：2、比例常數(shù)K①吸光系數(shù)aA=abc②摩爾吸光系數(shù)κ

c用mol·L-1表示，b用cm表示時，K用κ表示，稱為摩爾吸光系數(shù)，其單位為L·(mol.cm)-1。則：A=κbcκ在數(shù)值上等于濃度為1mol/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度。15κ越大表明該物質(zhì)的吸光能力越強(qiáng)，用光度法測定該物質(zhì)的靈敏度越高。

κ>105：超高靈敏；

κ=(6～10）×104

：高靈敏；

κ<2×104：不靈敏。桑德爾(Sandell)靈敏度(靈敏度指數(shù))用S來表示。

S是指當(dāng)儀器的檢測極限A=0.001時，單位截面積光程內(nèi)所能檢測出來的吸光物質(zhì)的最低含量，其單位為μg·cm-2，S與κ及吸光物質(zhì)摩爾質(zhì)量M的關(guān)系為：S=M/κ分光光度的靈敏度16【例】：有一濃度為1.0g/mlFe2+的溶液，以鄰二氮菲顯色后，在比色皿厚度為2cm、波長510nm處測得吸光度為0.380，計算（1

）透光度T；(2)吸光系數(shù)a；（3）摩爾吸光系數(shù)κ

。解（1）T＝10-A＝10-0.380＝0.417

（2）（3）1716-2-2吸光度的加合性A總

=∑Ai=κ1b1c1+κ2b2c2+……κnbncn

總的吸光度等于各個吸光物質(zhì)的吸光度之和?；蛉芤旱奈舛葢?yīng)等于溶液中各組分的吸光度之和。（組分間沒有干擾）A4A3A2A118溶液中多組分測定1916-2-3對朗伯-比爾定律的偏離

一、物理因素：

1、單色光不純，導(dǎo)致負(fù)偏差。CA標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖正誤差負(fù)誤差2、散射光的影響，膠體、乳濁液或懸濁液由于散射的作用使吸光度增大，或入射光不是垂直通過比色皿產(chǎn)生正偏差。20二、化學(xué)因素1、吸光質(zhì)點的相互作用，濃度較大時，產(chǎn)生偏差，

朗伯-比爾定律只適合于稀溶液（c<10-2mol·L-1)。2、平衡效應(yīng)，物質(zhì)的離解、締合、互變異構(gòu)及化學(xué)變化引起的偏離，如：

Fe(SCN)3=Fe3++3SCN-Cr2O72-+H2O=2CrO42-+2H+

21一、目視比色法：用眼睛比較溶液顏色深淺以確定物質(zhì)含量。（也叫標(biāo)準(zhǔn)色階法）12345

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液待測溶液§16-3比色法和分光光度法及其儀器22目視比色法的優(yōu)點是：1、儀器簡單，操作簡便，適宜于大批試樣分析。2、測定的靈敏度較高，適宜于稀溶液中微量元素的測定。3、

白光下進(jìn)行測定，因此有些顯色反應(yīng)不符合朗伯——比耳定律時，仍可用目視法測定。目視比色法的缺點是：1、有色溶液一般不太穩(wěn)定，常常臨時配制一套標(biāo)準(zhǔn)色階，較麻煩費時。2、依靠人的眼睛來觀察顏色深度，有主觀誤差，準(zhǔn)確度不高，相對誤差約為5～20%。23二、分光光度計

(spectrophotometer)通過棱鏡或光柵得到一束近似的單色光.波長可調(diào),故選擇性好,準(zhǔn)確度高.光源單色器吸收池檢測系統(tǒng)穩(wěn)壓電源分光光度法的基本部件：讀數(shù)指示器24分光光度計內(nèi)部光的傳播途徑251.光源(Lightsource)：發(fā)出所需波長范圍內(nèi)的連續(xù)光譜，有足夠的光強(qiáng)度,穩(wěn)定。 可見光區(qū)：鎢燈，碘鎢燈(320～2500nm)

紫外區(qū)：氫燈，氘燈(180～375nm)2.單色器(monochromator)：將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的裝置。棱鏡

光柵

玻璃350～3200nm,石英185～4000nm263.吸收池(cell):用于盛待測液及參比溶液。玻璃—能吸收UV光，僅適用于可見光區(qū)石英

—不吸收紫外光，適用于紫外和可見光區(qū)要求：匹配性（對光的吸收和反射應(yīng)一致）4.檢測器(detector)：利用光電效應(yīng)，將光能轉(zhuǎn)成電流訊號。 光電池，光電管，光電倍增管275.讀數(shù)指示器讀數(shù)指示器的作用是把光電流放大的信號以適當(dāng)方式顯示或記錄下來。通常使用懸鏡式光電反射檢流計測定產(chǎn)生的光電流。檢流計光點偏轉(zhuǎn)刻度直接標(biāo)為吸光度和透光率，測定時一般可直接讀出吸光度。2816.4顯色反應(yīng)與顯色條件的選擇顯色反應(yīng)在分光光度分析中，利用顯色反應(yīng)把待測組分M

轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩衔颩R，然后再進(jìn)行測定。使試樣中的被測組分與化學(xué)試劑作用生成有色化合物的反應(yīng)叫顯色反應(yīng)。所用試劑稱顯色劑。M(待測物)＋nR(顯色劑)＝MRn(有色化合物)

顯色反應(yīng)主要有配位反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)，其中絕大多數(shù)是配位反應(yīng)。2916-4-1對顯色反應(yīng)的要求1、靈敏度高，選擇κ較大的顯色反應(yīng)。避免共存組分干擾。2、選擇性好，顯色劑只與被測組分反應(yīng)。3、有色物組成固定，如：Fe3++磺基水楊酸→三磺基水楊酸鐵(黃色)

（組成固定）Fe3++SCN-→FeSCN2+、Fe(SCN)2+……

（組成不固定）304、有色物穩(wěn)定性高，其它離子干擾才小。如三磺基水楊酸鐵的Kf

=1042,F-

、H3PO4

對它無干擾。5、顯色過程易于控制，而且有色化合物與顯色劑之間的顏色差別應(yīng)盡可能大。31cRcRcR16.4.2顯色反應(yīng)條件的選擇（實驗確定）1、顯色劑的用量

，適當(dāng)過量。適宜的用量通過實驗求得(cM、pH一定)322、酸度（cM、cR一定）pH1<pH<pH2pH333、顯色時溫度和時間T1(℃)T2(℃)t(min)A4、溶劑的影響，有機(jī)溶劑會降低有色物的離解度，從而提高顯色反應(yīng)的靈敏度。34(3)改變干擾離子價態(tài)，測Ni2+時，F(xiàn)e2+

有干擾，加入氧化劑，F(xiàn)e2+→Fe3+.(4)分離干擾離子，用萃取、沉淀、電解、離子交換等方法。還可選擇適當(dāng)?shù)膮⒈热芤汉腿肷涔獾牟ㄩL等方法來消除共存離子的干擾。(2)加入掩蔽劑

，如用SCN-測定Co2+時，F(xiàn)e3+有干擾，加入F-:Fe3++6F-=FeF63-

;Fe3+

被掩蔽。

5、干擾物質(zhì)的影響及消除(1)控制酸度，使干擾離子不顯色。35§16-5分光光度法儀器測量誤差及其消除

16-5-1入射光波長的選擇。（545nm）最大吸收，最小干擾3616-5-2光度計讀數(shù)范圍的選擇透光率讀數(shù)的準(zhǔn)確度是儀器精度的主要指標(biāo)。測定結(jié)果的精度常用濃度的相對誤差dc/c表示。37若透光率刻度的讀數(shù)的絕對誤差為?T=1%，用不同的T代入上式，可得相應(yīng)濃度測量的相對誤差?c/c，作圖。0.20.40.60.81.00246810T0.368382、T在10%～70%(A=1.0～0.15)范圍，相對誤差較小。1、T=36.8%(A=0.4343)，相對誤差最小。由圖可見：為了減小濃度的相對誤差，提高測定的準(zhǔn)確度，一般應(yīng)控制溶液吸光度A在最適宜讀數(shù)范圍1.0～0.15。39(1)試樣、試劑、顯色劑都無色時，用純水作參比。(2)試樣無色，試劑、顯色劑有色，采用不加試樣的空白溶液作參比。√（試劑空白）(3)試樣有吸收，而顯色劑等無色，可采用不加顯色劑的試樣為參比。（試樣空白）(4)均有色，有吸收，對試樣加入掩蔽劑，褪色后再加顯色劑等作為參比。(褪色空白)16.5.3參比溶液的選擇

在吸光度測量中，作為比較的溶液或溶劑稱為參比溶液或空白溶液。40原理：朗伯—比爾定律（A=κbc）方法：（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法或工作曲線法（2）比較法16.5.4溶液濃度的測定41

先配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最大吸收波長處，測出它們的吸光度，作圖，同條件下測未知液的吸光度，從圖中查出未知液的濃度。cA工作曲線圖Axcxc1c2c3c4c5A1A2A3A4A51、工作曲線法42同條件下分別測定未知液與標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度Ax和A標(biāo)，根據(jù)朗伯-比爾定律，應(yīng)有下式：2、比較法因為：所以：4316.6分光光度法的某些應(yīng)用16-6-1

單組分測定（1）金屬離子:Fe-phen,Ni-丁二酮肟,Co-鈷試劑（2）磷的測定:DNA中含P～9.2%,RNA中含P～9.5%,可得核酸量.H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO4·12MoO3+12NH4NO3+12H2O磷鉬(Ⅵ)黃(κ小)磷鉬(V)藍(lán)(κ大)Vc4416-6-2多組分的測定

κxl1,κyl1,κxl2