分子生物學(xué)課件之復(fù)制

分子生物學(xué)課件之復(fù)制第1頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)：

DNA復(fù)制的基本原則第2頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月一、

SemiconservativeReplicationofDouble-StrandDNA第3頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月概念在復(fù)制過程中首先兩條親本鏈之間的氫鍵斷裂,雙鏈分開，然后以每條親本鏈（parentalstrand）為模板，按堿基互補(bǔ)配對原則(A:T，G:C)，由DNA聚合酶催化合成新的互補(bǔ)子鏈（daughterstrand）。復(fù)制結(jié)束后，每個(gè)子代DNA的一條鏈來自親代DNA，另一條鏈則是新合成的,并且，新形成的兩個(gè)DNA分子與原來的DNA分子的堿基序列完全相同。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制(semiconservationreplication)。第4頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月第5頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月第6頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA合成的底物是脫氧核苷5’－三磷酸（dNTP）：dATP，dGTP，dCTP和dTTP。復(fù)制的機(jī)制涉及到生長鏈的3’－OH對與模板上的堿基互補(bǔ)的dNTP的α－磷酸基團(tuán)進(jìn)行親核進(jìn)攻，釋放出焦磷酸。聚合反應(yīng)所需的能量來源于dNTP和焦磷酸的水解。

二、DNA復(fù)制的化學(xué)第7頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月第8頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月三、復(fù)制起點(diǎn)與復(fù)制子Replicon：

作為一個(gè)單位進(jìn)行復(fù)制的任何一段DNA序列。它含有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，有時(shí)還含有一個(gè)復(fù)制終點(diǎn)。Origin

：是復(fù)制子起始復(fù)制的一段DNA序列。第9頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月作為一個(gè)單位進(jìn)行復(fù)制的任何一段DNA序列。復(fù)制子的復(fù)制通常從一個(gè)固定的位點(diǎn)開始的，這種起始DNA復(fù)制的序列叫做復(fù)制起點(diǎn)。DNA復(fù)制時(shí)，雙螺旋的兩條鏈在復(fù)制起點(diǎn)處分開形成兩條模板鏈。一旦復(fù)制開始，就會在DNA分子上形成兩個(gè)復(fù)制叉（replicationfork）。復(fù)制叉向著未復(fù)制的它們沿著DNA相向移動，因此復(fù)制是雙向的。所有的原核生物的染色體，很多噬菌體和病毒的DNA分子是環(huán)狀的，它們作為單個(gè)復(fù)制子完成復(fù)制。

第10頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月第11頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月真核生物染色體的線狀DNA則含有多個(gè)復(fù)制子，每一個(gè)復(fù)制子都有自己的復(fù)制起點(diǎn)。一個(gè)典型的哺乳動物細(xì)胞有50000－100000個(gè)復(fù)制子，復(fù)制子的長度為40－200Kb。正在復(fù)制的真核生物基因組DNA分子上，會形成許多復(fù)制泡。隨著復(fù)制叉沿著DNA分子向兩個(gè)方向移動，復(fù)制泡不斷變大，最終，兩個(gè)相鄰復(fù)制泡的復(fù)制叉會相遇、融合，完成DNA的復(fù)制。

第12頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月第13頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月第14頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月四、DNA的半不連續(xù)復(fù)制第15頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月在復(fù)制叉處，DNA的兩條鏈都作為模板同時(shí)合成兩條新鏈。DNA分子的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模鳧NA復(fù)制時(shí)無論以那條鏈做模板，新合成的鏈?zhǔn)前?’→3’方向進(jìn)行的，所以只有一條模板鏈指導(dǎo)合成的新生鏈能夠沿著復(fù)制叉運(yùn)動的方向連續(xù)復(fù)制，此新合成的鏈稱為前導(dǎo)鏈（leadingstrand）。另一條模板鏈指導(dǎo)合成的新生鏈也是沿5’→3’方向進(jìn)行，但與復(fù)制叉前進(jìn)的方向相反，是分段合成的，這些片斷于1969年首先在大腸桿菌中分離出來，被稱為岡崎片段。

第16頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月第17頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月在細(xì)菌中岡崎片段長約1000－2000核苷酸，但在真核生物中，相應(yīng)片斷的長度可能短得多，由100～400個(gè)核苷酸組成。合成的片段即為岡崎片段。這些岡崎片段以后由DNA連接酶連成完整的DNA鏈，因此岡崎片段是DNA復(fù)制中短暫的中間產(chǎn)物。這條鏈不連續(xù)合成的鏈稱為滯后鏈(laggingstrand)。這種前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制在生物界是普遍存在的，稱為DNA合成的半不連續(xù)復(fù)制。第18頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月第19頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月OnestrandreplicatedascontinuoussegmentOtherreplicatedinshortsegments

(tobejoinedlaterbyligase)Replication

ForkPPPPSSSSContinuousSegmentedUnzipping第20頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月五、RNA引導(dǎo)目前已知的DNA聚合酶都只能延伸已經(jīng)存在的DNA鏈，而不能從頭啟動DNA鏈的合成，這是因?yàn)樗诤铣蒁NA時(shí)需要一個(gè)自由的3’OH。那么一個(gè)新的DNA鏈的合成是如何開始的呢？研究發(fā)現(xiàn)，DNA復(fù)制時(shí)還需要另外一種酶來合成一段RNA作為合成DNA的引物。在細(xì)菌中，引物合成依靠引物酶（primase），它是一種與轉(zhuǎn)錄酶不相關(guān)的RNA聚合酶。第21頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月引物酶不需要用特異DNA序列來起始RNA引物的合成，被激活后，即用最新暴露的后隨鏈模板合成RNA引物。每個(gè)引物的長約5個(gè)核苷酸。一旦引物合成就由DNA聚合酶III繼續(xù)鏈的合成。在真核細(xì)胞中，引物酶由DNA聚合酶α的最小的亞基擔(dān)任。前導(dǎo)鏈的合成只需要在復(fù)制起點(diǎn)引發(fā)一次，因?yàn)橐坏┮锖铣桑皩?dǎo)鏈就可以連續(xù)復(fù)制直至結(jié)束。對后隨鏈來說，引物的合成是個(gè)重復(fù)的過程，因?yàn)槊块_始合成一個(gè)新的岡崎片斷就需要一段引物。第22頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月第23頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)：細(xì)菌DNA復(fù)制第24頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月一、復(fù)制的起始1.大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)（OriC）大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)稱為OriC。將大腸桿菌的染色體隨機(jī)斷裂后插入到缺乏復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒中，由于質(zhì)粒上含有選擇標(biāo)記，凡能存活的克隆，質(zhì)粒中都含有一段控制DNA復(fù)制的序列。通過缺失分析鑒定出大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)約有240bp組成。

第25頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月該序列含有兩個(gè)短的重復(fù)基序，兩個(gè)基序的長度分別為9bp和13bp。9bp基序共有4個(gè)拷貝，分散于整個(gè)OriC的范圍內(nèi)，它是DnaA蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。通過DnaA蛋白與OriC的相互作用以及DnaA蛋白之間的相互作用，大約30個(gè)DnaA蛋白結(jié)合在復(fù)制起始區(qū)。這種結(jié)合只能發(fā)生在負(fù)超螺旋DNA分子上，而負(fù)超螺旋是大腸桿菌染色體的正常存在狀態(tài)。

第26頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月第27頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA分子在DnaA蛋白復(fù)合體上的纏繞，導(dǎo)致雙螺旋在串連排列的3個(gè)富含AT的13bp基序處解開。一般認(rèn)為螺旋解開是由于DNA雙螺旋在DnaA蛋白復(fù)合體上纏繞后產(chǎn)生的扭轉(zhuǎn)張力的結(jié)果。

第28頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA雙螺旋的進(jìn)一步打開需要DnaB蛋白。DnaB蛋白是解旋酶（Helicase），其作用是解開DNA雙鏈。兩個(gè)DnaB蛋白在復(fù)制起點(diǎn)處分別與兩條單鏈結(jié)合，并按5’→3’相向而行打開DNA雙鏈。在復(fù)制起點(diǎn)處DNA雙鏈打開以后，DnaA蛋白便會募集由6個(gè)DnaB和6個(gè)DnaC構(gòu)成的復(fù)合體與起始位點(diǎn)處的單鏈DNA結(jié)合。DnaC為DnaB蛋白裝載因子，依靠DnaC蛋白的單鏈DNA結(jié)合域以及與DnaA蛋白的相互作用，DnaB和DnaC蛋白復(fù)合體結(jié)合在復(fù)制起始位點(diǎn)。Helicase(DnaB)continuestoseparatestrands第29頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月第30頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月然后，DnaC催化DnaB蛋白解環(huán)，并套在單鏈DNA上。在DnaB和DnaC蛋白復(fù)合體中，DNA解旋酶保持非活性狀態(tài)。DNA解旋酶的安裝導(dǎo)致裝載因子從復(fù)合體中釋放出來，并激活DNA解旋酶。DNA解旋酶向前運(yùn)動，在其身后留下單鏈DNA模板。第31頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月接著單鏈結(jié)合蛋白（single-strandedbindingprotein,SSB）與解旋酶解開的單鏈結(jié)合，其作用是防止單鏈降解，阻止單鏈退火。SSB蛋白與單鏈DNA的結(jié)合有協(xié)同效應(yīng)(cooperative)，即一個(gè)SSB的結(jié)合會促進(jìn)另一個(gè)SSB與單鏈DNA的結(jié)合。這種協(xié)同結(jié)合使單鏈DNA被解旋酶釋放出后，很快被SSB所覆蓋。一旦被SSB覆蓋，單鏈DNA即處于伸直狀態(tài)，有利于其作為模板進(jìn)行DNA合成或RNA引物的合成。第32頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月在大腸桿菌細(xì)胞中，DNA解旋酶募集一個(gè)引物酶。引物酶負(fù)責(zé)合成一段短的RNA引物。第33頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月第34頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月二、

Elongation一旦復(fù)制起始，復(fù)制叉就沿著DNA分子前進(jìn)，合成與親本鏈互補(bǔ)的兩條新DNA鏈。新生鏈的合成由DNA聚合酶催化完成。從大腸桿菌細(xì)胞中分離出了5種DNA聚合酶。DNA聚合酶III是大腸桿菌DNA復(fù)制中鏈延伸反應(yīng)的主要聚合酶。DNA聚合酶I專門用于RNA引物的去處。另外3種DNA聚合酶主要參與DNA修復(fù)和跨損傷合成。第35頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月1．DNA聚合酶IDNApolI由一條多肽鏈組成，分子量為109KD。酶分子中含有一個(gè)Zn2＋，是聚合酶活性必需的。用枯草桿菌蛋白酶可將此酶水解成兩個(gè)片段，大片段的分子量為76KD，通常稱為klenow片段，小片段為34KD。大小片段具有不同的酶活性。第36頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月1.easilycleavedintotwofragmentsbyproteinase: a.largefragment(Klenowfragment)containspolymeraseand3’-5’exonuclease(proofreadingdomain).Usedinvitroforsynthesisreactions(DNA

sequencing).E.coliDNApolI(polA)NCKlenowfragment(68kD)exonuclease3’-5’polymerasesitesmallfragment(35kD)C5’-3’activityproofreadingexonucleasecatalytic第37頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）DNA聚合酶的5'→3'聚合活性第38頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月這是DNA聚合酶最主要的活性，按模板DNA上的核苷酸順序，將互補(bǔ)的dNTP逐個(gè)加到引物RNA3’-OH末端，即促進(jìn)3'-OH與dNTP的5'-PO4形成磷酸二酯鍵，酶的專一性表現(xiàn)為新進(jìn)入的dNTP必須與模板DNA堿基配對時(shí)才有催化作用，5'→3'聚合活性存在于klenow片段上。DNA聚合酶I的延伸能力不強(qiáng)，每次與模板－引物結(jié)合僅能添加20～100個(gè)核苷酸。

第39頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）DNA聚合酶的3’→5’外切核酸酶（exonuclease)活性

這種酶活性的主要功能是從3’→5’方向識別并切除DNA生長鏈末端與模板DNA不配對的核苷酸，這種功能稱為校對功能（proofreading），這是保證其聚合作用的正確性不可缺少的，因此對于維持DNA復(fù)制的真實(shí)性（replicationalfidelity）至關(guān)重要。第40頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月ProofreadingbyDNApolymerase第41頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月第42頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月(3)DNA聚合酶的5'→3'外切核酸酶活性這種酶活性是從DNA鏈的5’端向3’末端水解已配對的核苷酸，本質(zhì)是切斷磷酸二酯鍵，每次能切除10個(gè)核苷酸。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復(fù)中可能起重要作用，對完成的DNA片段去除5’端的RNA引物也是必須的。DNApolⅠ的5'→3'聚合活性和5'→3'外切酶活性協(xié)同作用，可以使DNA一條鏈上的切口從5'→3'方向移動，這種反應(yīng)叫做缺刻平移(nicktranslation)第43頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月第44頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月2.DNAPolymeraseIII(DNA聚合酶III）

DNA聚合酶III由10個(gè)不同的亞基構(gòu)成。其中α、ε和θ亞基構(gòu)成核心酶。α亞基具有5'→3'聚合酶活性，ε亞基具有3'→5'外切活性，θ亞基功能尚不清楚，可能僅僅起結(jié)構(gòu)上的作用，使兩個(gè)核心亞基以及其他各輔助亞基裝備在一起。DNA聚合酶III具有兩個(gè)拷貝的核心酶。

第45頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月(Note:nobetasubunitsareshown;withoutbeta,thisformofthecomplexiscalledDNApolIII*)第46頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月

兩個(gè)拷貝的β亞基圍繞DNA雙螺旋形成一個(gè)環(huán)狀的二聚體。一旦β亞基二聚體與DNA緊密結(jié)合，它的作用就像一個(gè)“滑動夾子”(slidingclamp)攜帶著核心聚合酶沿著DNA鏈自由滑動。這樣，聚合酶的活性位點(diǎn)就可以一直定位在生長中的復(fù)制叉附近。另一方面，核心酶與滑動夾結(jié)合后，其延伸能力也顯著提高。DNA聚合酶的延伸能力（processivity）定義為每次聚合酶與模板－引物結(jié)合時(shí)所能添加的核苷酸的平均數(shù)。與滑動夾的結(jié)合是如何改變DNA聚合酶的延伸能力的呢？在無滑動夾的情況下，DNA聚合酶平均每合成20～100個(gè)核苷酸就從DNA模板上脫落下來。

第47頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月BetaformsadonutshapedringaroundtheDNAandhelpstoanchortheholoenzymetotheDNAduringreplication.Byactingasasliding"clamp",betahelpstheholoenzymetoreplicatelongstretchesofDNAwithout"fallingoff"thestrand(thisiscalledprocessivity).第48頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月但是，滑動夾可以阻止聚合酶脫落，從而大大增加了DNA聚合酶的延伸能力。聚合酶的第3個(gè)組成部分是由5個(gè)亞基構(gòu)成的一個(gè)所謂的γ復(fù)合體。γ復(fù)合體又稱夾子裝載因子（clamploader），催化滑動夾打開，并將其結(jié)合在引物－模板上。介導(dǎo)β亞基與模板－引物雙螺旋的結(jié)合。最后，兩個(gè)拷貝的τ亞基使核心聚合酶形成二聚體。第49頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月(Note:nobetasubunitsareshown;withoutbeta,thisformofthecomplexiscalledDNApolIII*)第50頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月ThesubunitsofE.coliDNApolymeraseIIISubunitFunctionaeqtbgdd’cy5’to3’polymerizingactivity3’to5’exonucleaseactivityaandeassembly(scaffold)AssemblyofholoenzymeonDNASlidingclamp=processivityfactorClamp-loadingcomplexClamp-loadingcomplexClamp-loadingcomplexClamp-loadingcomplexClamp-loadingcomplexCoreEnzymedimerHoloenzyme第51頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月3．在復(fù)制叉處先導(dǎo)鏈和后隨鏈的合成同時(shí)進(jìn)行RNA引物合成以后，DNA的延伸過程便開始了。先導(dǎo)鏈被連續(xù)合成，而后隨鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)合成的。在復(fù)制叉上，DNA解旋酶在后隨鏈模板上沿著5'→3'運(yùn)動。DNA聚合酶III全酶通過τ亞基和解旋酶相互作用，兩個(gè)τ亞基分別與一個(gè)核心酶結(jié)合，其中一個(gè)核心酶復(fù)制前導(dǎo)鏈，另一個(gè)核心酶復(fù)制后隨鏈。

第52頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA引物酶周期性地與DNA解旋酶結(jié)合，并在后隨鏈模板上合成新的引物。當(dāng)負(fù)責(zé)后隨鏈合成的核心酶完成一個(gè)岡崎片段的合成后，即從滑動夾和DNA上脫落下來。隨后，DNA聚合酶III的滑動夾裝載因子在新形成的模板接頭位置上，組裝新的滑動夾。新組裝的滑動夾與核心酶結(jié)合，起始下一個(gè)岡崎片段的合成。第53頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月第54頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月新合成的岡崎片段與上一個(gè)岡崎片段被一切口分開。岡崎片段的RNA引物長約5個(gè)核苷酸，而它的DNA部分長約1000～20