如何解析蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)

如何解析蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)第1頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，首先需要得到純的蛋白質(zhì)樣品。問(wèn)題的提出：第2頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）蛋白質(zhì)的兩性電離一、理化性質(zhì)蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。

*蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)§6蛋白質(zhì)的性質(zhì)及其分離純化

第3頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)第4頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可達(dá)100萬(wàn)之巨，其分子的直徑可達(dá)1～100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。*蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素：顆粒表面電荷(電荷層）水化膜第5頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉第6頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（三）蛋白質(zhì)的變性、沉淀和凝固

*蛋白質(zhì)的變性(denaturation)在某些物理和化學(xué)因素作用下，其特定的空間構(gòu)象被破壞，也即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無(wú)序的空間結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。第7頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

造成變性的因素如加熱、乙醇等有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬離子及生物堿試劑等。

變性的本質(zhì)——

破壞非共價(jià)鍵和二硫鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。第8頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

應(yīng)用舉例臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用來(lái)消毒及滅菌。此外,防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。

第9頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月變性蛋白質(zhì)的性質(zhì)改變：①物理性質(zhì)：旋光性改變，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；②化學(xué)性質(zhì)：官能團(tuán)反應(yīng)性增加，易被蛋白酶水解。③生物學(xué)性質(zhì)：原有生物學(xué)活性喪失，抗原性改變。若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為復(fù)性(renaturation)。變性蛋白質(zhì)的復(fù)性：第10頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

天然狀態(tài)，有催化活性

尿素、β-巰基乙醇

去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無(wú)活性第11頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月*蛋白質(zhì)沉淀在一定條件下，蛋白疏水側(cè)鏈暴露在外，肽鏈融會(huì)相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性。*蛋白質(zhì)的凝固作用(proteincoagulation)蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅(jiān)固的凝塊，此凝塊不易再溶于強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中。

第12頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（四）蛋白質(zhì)的紫外吸收由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長(zhǎng)處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測(cè)定。第13頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（五）蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)⒈茚三酮反應(yīng)(ninhydrinreaction)

蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應(yīng)。⒉雙縮脲反應(yīng)(biuretreaction)蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)，雙縮脲反應(yīng)可用來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)水解程度。第14頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、蛋白質(zhì)的分離和純化（一）透析及超濾法*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開(kāi)的方法。*超濾法

應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過(guò)有一定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。第15頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀

*使用丙酮沉淀時(shí)，必須在0～4℃低溫下進(jìn)行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。*鹽析(saltprecipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。第16頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月*

免疫沉淀法：將某一純化蛋白質(zhì)免疫動(dòng)物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識(shí)別相應(yīng)的抗原蛋白，并形成抗原抗體復(fù)合物的性質(zhì)，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白。第17頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（三）電泳蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場(chǎng)中能向正極或負(fù)極移動(dòng)。這種通過(guò)蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù),稱為電泳(elctrophoresis)。第18頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月電泳的類型

目前電泳的類型很多，最常見(jiàn)的是區(qū)帶電泳，由于在支持物上電泳時(shí)蛋白質(zhì)混合物被分離成若干區(qū)帶而得名。第19頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月區(qū)帶電泳按其支持物的物理性狀不同可以分成幾類：①濾紙電泳和薄膜電泳(如醋酸纖維薄膜電泳和聚酰胺薄膜電泳)；②粉末電泳，支持介質(zhì)是淀粉、纖維素粉或硅膠粉等，粉末與適當(dāng)?shù)娜軇┱{(diào)和，鋪設(shè)成平板；第20頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月③凝膠電泳，最常用的支持介質(zhì)有聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠，前者適于分離蛋白質(zhì)和多核苷酸，后者適于分離核酸，這兩種凝膠電泳的分辨率都很高，

-++—第21頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第22頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月雙向電泳(two-dimensionalelectrophoresis)第23頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月記住這幾種重要的蛋白質(zhì)電泳*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定。*等電聚焦電泳，通過(guò)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。*雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。第24頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（四）層析層析(chromatography)分離蛋白質(zhì)的原理待分離蛋白質(zhì)溶液（流動(dòng)相）經(jīng)過(guò)一個(gè)固態(tài)物質(zhì)（固定相）時(shí)，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。第25頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第26頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)分離常用的層析方法*離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。凝膠過(guò)濾(gelfiltration)又稱分子篩層析，利用各蛋白質(zhì)分子大小不同分離。親和層析(affinitychromatography)是利用蛋白質(zhì)分子對(duì)其配體分子特有的識(shí)別能力，也即生物學(xué)親和力（底物和酶，抗原與抗體，酶與抑制劑，受體與底物等），建立起來(lái)的一種有效的純化方法。它經(jīng)常只需要經(jīng)過(guò)一步的處理即可將某種所需蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中分離出來(lái)，并且純度相當(dāng)高。第27頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第28頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第29頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月親和層析第30頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（五）超速離心

ultracentrifugation*既可以用來(lái)分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。*蛋白質(zhì)在離心場(chǎng)中的行為用沉降系數(shù)(sedimentationcoefficient,S)表示,沉降系數(shù)與蛋白質(zhì)的密度和形狀相關(guān)。第31頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)純化方法總結(jié)：根據(jù)蛋白質(zhì)在溶液中的性質(zhì)分離純化蛋白質(zhì)的方法：①分子大?。虎谌芙舛?；③電荷；④吸附性質(zhì)；⑤對(duì)配體分子的生物學(xué)親和力等。

透析離心沉淀電泳層析第32頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、蛋白質(zhì)含量測(cè)定

總蛋白質(zhì)含量測(cè)定有兩類方法：

1、利用蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)，如折射率、比重、紫外吸收等測(cè)定。

2、利用化學(xué)方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，如微量凱氏定氮、雙縮脲反應(yīng)、Folin-酚試劑法(又名Lowry法)。這兩類方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，選用何種方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求及實(shí)驗(yàn)室條件進(jìn)行選擇。原理都是利用蛋白質(zhì)的成色反應(yīng)或紫外吸收的性質(zhì)，通過(guò)分光光度法來(lái)測(cè)定。§7蛋白質(zhì)的含量測(cè)定與純度鑒定第33頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.凱氏定氮法是經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)方法，用濃硫酸消化蛋白質(zhì)分解出氨，測(cè)定氨的含量，除以16%，就得出蛋白質(zhì)的含量。第34頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.雙縮脲法蛋白質(zhì)在堿性溶液中，能與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，故可以用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。凡含有雙縮脲相似結(jié)構(gòu)的物質(zhì)均能參與反應(yīng)，常用于需要快速但并不需要十分精確的測(cè)定。第35頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.Lowry法(Folin-酚法)

Folin-酚試劑由甲試劑與乙試劑組成。甲試劑由碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅及酒石酸鉀鈉組成。乙試劑是由磷鉬酸和磷鎢酸、硫酸、溴等組成。機(jī)理：蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性條件下，與酒石酸鉀鈉銅鹽溶液起作用，生成紫紅色絡(luò)合物（組成不清楚）。第36頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Lowry法目前實(shí)驗(yàn)室多用Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。此法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，迅速，不需特殊儀器設(shè)備，靈敏度高，較紫外吸收法靈敏10—20

倍，較雙縮脲法靈敏100倍，反應(yīng)約在15min內(nèi)有最大顯色，并至少可穩(wěn)定幾小時(shí)。其不足之處是此反應(yīng)受多種因素干擾。在測(cè)試時(shí)應(yīng)排除干擾因素或做空白試驗(yàn)消除。

第37頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.紫外吸收法

由于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì)，吸收高峰在280nm波長(zhǎng)處。在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值(A280)與其含量呈正比關(guān)系，可用作定量測(cè)定。第38頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月紫外吸收法的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測(cè)定。因此，在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中(特別是在柱層析分離中)廣泛應(yīng)用。缺點(diǎn)：(1)對(duì)于測(cè)定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差，(2)若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外線的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。第39頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5.考馬斯亮藍(lán)染色法蛋白質(zhì)的存在會(huì)影響酸堿滴定中所用某些指示劑的顏色變化，從而改變這些染料的光吸收。在此基礎(chǔ)上，發(fā)展蛋白質(zhì)染色測(cè)定方法。涉及的指示劑有甲基橙、考馬斯亮藍(lán)、溴甲酚綠和溴甲酚紫，目前廣泛使用的染料是考馬斯亮藍(lán)。考馬斯亮藍(lán)R-250和蛋白質(zhì)通過(guò)范德瓦爾鍵結(jié)合，呈藍(lán)色，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的染色符合比爾定律。2—5min即呈現(xiàn)最大光吸收，至少穩(wěn)定1h。本方法可允許的測(cè)定范圍是2—20ug蛋白質(zhì)。受蛋白質(zhì)的特異性影響較小，除組蛋白外，其他不同種類蛋白質(zhì)的染色強(qiáng)度差別不大。第40頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6.膠體金測(cè)定法膠體金是